早期哺乳動物胚胎主要由三種不同組織發(fā)育而來:外胚層（epiblast）來源的胚胎組織，滋養(yǎng)外胚層（trophectoderm）來源的胎盤以及原始內胚層（primitive endoderm）來源的卵黃囊，胚胎組織與上述兩種胚外組織相互調節(jié)、共同協(xié)作是胚胎結構完整功能完善的重要前提。胚胎植入后，臟側內胚層（visceral endoderm, VE, 可發(fā)育為原始內胚層）誘導外胚層極化并開始成腔，隨后與滋養(yǎng)外胚層來源的胚外外胚層的腔整合形成前羊膜腔，這些過程的正常進行對后續(xù)的胚胎對稱發(fā)育狀態(tài)打破、前后軸形成及原腸胚形成的起始至關重要。

由于缺乏來自胚外組織的信號誘導，單獨培養(yǎng)胚胎干細胞（ESCs）時，其細胞數(shù)量及空間構造都與正常胚胎有所區(qū)別，因此其模擬早期胚胎發(fā)育關鍵事件的作用很有限。英國劍橋大學的Magdalena Zernicka-Goetz教授團隊將小鼠胚胎干細胞（ESCs）與胚外滋養(yǎng)層干細胞（TSCs）共培養(yǎng)可體外自發(fā)組裝成ETS胚胎，此ETS胚胎雖然可重現(xiàn)出類似正常早期胚胎發(fā)育的前羊膜腔形成-中胚層發(fā)育-原始生殖細胞發(fā)育等關鍵事件，但是其并不能經(jīng)歷上皮-間質轉化等過程（epithelial–mesenchymal transition ，EMT）形成原腸胚，ETS胚胎發(fā)育潛力的不足是否由于此共培養(yǎng)體系中缺乏可發(fā)育為原始內胚層的VE組分呢？在此體系中加入VE組分是否可擴大ETS胚胎的發(fā)育潛力呢？

     研究人員將ESCs、 TSCs及XENs細胞的單細胞混懸液共培養(yǎng)于倒三角的微孔板中，共培養(yǎng)96h后發(fā)現(xiàn)：約70%的圓柱形結構由ESCs、 TSCs及XENs三種細胞構成，其中的29.8%僅包含一個TSCs和ESCs組分，并且外層由一層XENs細胞包繞，稱為ETX胚胎。通過進一步比較ETX胚胎與E5.5正常發(fā)育胚胎各組分的形態(tài)、細胞數(shù)量以及不同細胞譜系標志分子的表達（Oct4標記胚胎組分、Tfap2c標記胚外外胚層組分、Gata6標記VE組分），結果二者的上述各項參數(shù)均無顯著差異；表明體外培養(yǎng)的ESCs、TSCs和XENs細胞可自發(fā)組裝為胚胎樣結構，即ETX胚胎（圖1）。

圖1.ESCs，TSCs和XENs可體外自發(fā)組裝為ETX胚胎

與正常發(fā)育胚胎類似，ETX胚胎同樣可發(fā)生ESCs和TSCs交界處中胚層和原始生殖細胞標志分子的不對稱表達，并且XENs可發(fā)揮VE組分的部分功能：形成ESTs和TSCs組分中間的基底膜（Laminin陽性），并伴隨前羊膜腔的整合消失。

小鼠胚胎發(fā)育E5.25時，胚胎部分的VE由鱗形和方形細胞混合而成，至E6.75，其均變成了鱗形細胞，此時胚外外胚層部分的VE則主要由方形細胞組成。與此類似，體外培養(yǎng)D5的ETX胚胎ESCs部分的XENs也主要呈現(xiàn)鱗形，而TSCs部分的XENs則仍然保持方形。XENs與VE細胞分布和形態(tài)的相似性也進一步表明XENs可以某種程度模擬VE的生理作用（圖2）。

圖2. ETX胚胎的XENs層分布與正常胚胎類似

正常小鼠胚胎發(fā)育的VE功能區(qū)域化會誘導外胚層前后軸Nodal信號的不對稱表達，而連續(xù)觀察體外培養(yǎng)D4至D5的ETX胚胎也同樣發(fā)現(xiàn)：Nodal信號在ESCs區(qū)域的表達由基本無差異變?yōu)椴粚ΨQ高表達于后軸；同時前臟側內胚層（anterior visceral endoderm ，AVE）特異標志分子Lefty1及胚胎前后軸形成調節(jié)分子Otx2的表達模式與正常胚胎也非常類似。上述結果表明ETX胚胎的XENs層發(fā)生功能區(qū)域化，并且可模擬正常發(fā)育胚胎AVE的特異發(fā)生：即其可在ESCs組分T/Brachyury與Nodal陽性區(qū)域的對側誘導AVE相應標志分子的特異表達（圖3）。

圖3. ETX胚胎XENs層區(qū)域化分布

小鼠原腸胚形成階段，T/Brachyury陽性細胞可發(fā)生EMT并遷移至外胚層與VE之間。體外培養(yǎng)D5的ETX胚胎亦可發(fā)現(xiàn)：瓶形的T/Brachyury陽性細胞其細胞核平行于基底膜，并且高表達Snail、Vimentin、Mmp9等EMT相關標志分子。進一步實時跟蹤發(fā)現(xiàn)，隨著體外培養(yǎng)時間延長，ETX胚胎ESCs與TSCs交界處T/Brachyury陽性細胞極性改變，并且由瓶形的具備遷移特性的細胞逐漸變成方形的間質細胞；此外，T/Brachyury陽性區(qū)域外包繞的Laminin陽性的基底膜也被打破，T/Brachyury的表達與基底膜的打破均受Wnt信號通路調控。上述發(fā)現(xiàn)表明：與正常發(fā)育胚胎類似，ETX胚胎同樣可發(fā)生EMT-細胞遷移過程（圖4）。

圖4. 原腸胚樣的ETX胚胎可發(fā)生上皮-間質轉化

隨后，研究人員進一步發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)D5至D6的ETX胚胎XENs層及某些ESCs細胞表達終末內胚層標志分子Foxa2，而共表達Foxa2和T / Brachyury的細胞位于胚胎后軸遠端，E7.0時其會發(fā)育為前原條。上述研究表明：原腸胚階段的ETX胚胎其中胚層發(fā)育與正常胚胎非常類似（圖5）。

圖5. 原腸胚樣的ETX胚胎軸向中胚層的特異形成

      正常情況下，前原條內的終末內胚層細胞逐漸與VE整合并替代，而類原腸胚階段的ETX胚胎同樣也可發(fā)生類似的發(fā)育事件：體外培養(yǎng)D5時，ESCs組分與XENs組分之間共表達Foxa2和Sox17的細胞與XENs組分接觸；D6時XENs組分中開始出現(xiàn)Foxa2陽性的終末內胚層細胞，而D6晚期，ESCs來源的終末內胚層細胞已經(jīng)大量取代XENs組分，進一步證明原腸胚樣的ETX胚胎不僅可發(fā)育出中胚層，也可以發(fā)育出終末內胚層（圖6）。

圖6. 原腸胚樣的ETX胚胎可發(fā)育出終末內胚層

      為了進一步證明原腸胚樣的ETX胚胎與正常發(fā)育胚胎的相似性，作者將體外培養(yǎng)D5的ETX胚胎中T / Brachyury陽性細胞（side2）與陰性細胞（side1）分別分離出來進行深度測序，結果發(fā)現(xiàn)2群細胞的基因表達模式很不相同；通過進一步分析差異表達基因，證明side1的表達模式更接近前軸，side2則與后軸更相似。鄰域連接樹分析更精細的表明：side2的表達模式與E7.0的胚胎后軸更接近，side1則更接近E7.5的胚胎前軸。這些結果更好的佐證了：體外自發(fā)重組的ETX胚胎可模擬正常生長發(fā)育的原腸胚形成（圖7）。

圖7. 原腸胚樣的ETX胚胎前后軸表達模式的轉錄譜與正常原腸胚整體相似

本文作者在前期體外自發(fā)重組ETS胚胎的基礎上，加入了原始內胚層組分（XENs細胞），同樣發(fā)現(xiàn)ESCs、TSCs和XENs三種干細胞可體外自發(fā)重組為ETX胚胎，擴大了此胚胎的發(fā)育潛力：ETX胚胎不僅胚胎形態(tài)和基因表達模式與正常發(fā)育胚胎相似，還可以序貫發(fā)生軸向中胚層及終末內胚層特定分化等原腸胚形成過程中的重要事件，為研究相應時間-空間上的多胚層對話和潛在分子機制提供了有效的離體模型。但此模型依然存在不足：首先，細胞進入中胚層時并不伴隨T / Brachyury陽性信號均勻分布；其次，ETX胚胎雖然可形成原腸胚，但是其最終結構并不完整；值得注意的時，即便是正常發(fā)育的胚胎，在體外培養(yǎng)時其形成原腸胚的結構也不如體內完善，提示此過程的發(fā)生機制仍然需要更多研究來揭示。相信共培養(yǎng)體系的不斷優(yōu)化和擴展，共培養(yǎng)組分的不斷豐富，早期胚胎發(fā)育的黑匣子會逐漸被解析。