2型糖尿病是以高血糖和脂代謝異常為特征的慢性代謝性疾病，隨著糖尿病在各人口大國的患病率和死亡率逐漸上升，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。流行病學(xué)研究表明，心血管疾病是糖尿病的主要并發(fā)癥，是糖尿病患者致死的首要原因，約60%的糖尿病患者死于心血管并發(fā)癥。內(nèi)皮功能紊亂是導(dǎo)致糖尿病心血管并發(fā)癥的主要原因，血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。體內(nèi)外高糖、高脂環(huán)境通過氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老，隨之獲得衰老相關(guān)分泌表型，活化和分泌大量炎癥細(xì)胞因子，促進(jìn)血管慢性炎癥擴(kuò)散、單核細(xì)胞累積和血栓形成，加速血管內(nèi)皮功能紊亂和糖尿病心血管并發(fā)癥形成。中藥人參、三七、川芎屬于益氣活血中藥的范疇，藥理學(xué)研究顯示，上述3種中藥的有效成分均具有較好的抗衰老功效，并且還具有擴(kuò)張血管、逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)以及促進(jìn)血管新生等作用。綜上，探討高糖高脂環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的病理機(jī)制，對(duì)糖尿病及心血管并發(fā)癥的研究具有重要意義。目前研究多集中在高糖或高脂導(dǎo)致的血管內(nèi)皮功能紊亂或者損傷。本課題組前期研究的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建高糖高脂誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老模型，探討人參-三七-川芎提取物能否延緩細(xì)胞衰老，為糖尿病及心血管并發(fā)癥的治療提供新思路。

1.1 細(xì)胞  人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（human aortic endothelial cells，HAEC，批號(hào)6100），購自美國Sciencell公司。

1.2 藥物及試劑  人參、三七、川芎合劑凍干粉，北京因科瑞斯醫(yī)藥科技公司制備提供。藥物為道地藥材，按2:3:4比例破碎成粗粉，經(jīng)過醇提、濃縮、真空減壓制成干膏粉，最終每克凍干粉相當(dāng)于生藥4.286 g，使用時(shí)以DPBS配制成10 g·L^-1的貯存液，以0.22 μm的濾器過濾分裝，保存于－20 ℃冰箱中。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、青霉素/鏈霉素溶液、胰酶消化液、細(xì)胞凍存液(美國Sciencell公司，批號(hào)分別為1001,0025,1052,0503,0103,0133)；D-glucose，棕櫚酸鈉（美國Sigma公司，批號(hào)分別為SLBR0902V，SLBV2022）；無脂肪酸BSA（d-BSA）（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)1206F052）；細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖檢測(cè)（CCK-8）試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所，批號(hào)LG615)；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶檢測(cè)試劑盒，線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒JC-1（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為C0602，C2006）；MitoSOX RED熒光探針（美國Thermo公司，批號(hào)1906247）；p-H2A.X（Ser139）兔單克隆抗體（美國CST公司，批號(hào)9718）；p21兔單克隆抗體，p16兔單克隆抗體，山羊抗兔IgG H＆L（Alexa Flour488）（英國Abcam公司，批號(hào)分別為ab109199，ab51243，ab1500777）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)ZB-2301）。

1.3 儀器  AE2000型倒置相差顯微鏡及成像系統(tǒng)（中國麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；Forma 370型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；Synergy H1型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司）；FV1000型激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell型電泳槽系統(tǒng)，PowerPac universal power supply型通用電泳儀電源，Trans-blot sp cell型半干轉(zhuǎn)印槽（美國Bio-Rad公司）。

2.1 HAEC細(xì)胞培養(yǎng)  HAEC細(xì)胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、青霉素/鏈霉素（100 U·L^-1/100 mg·L^-1）的完全培養(yǎng)基，于飽和適度的5%CO₂培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，2~3 d換液1次。培養(yǎng)至細(xì)胞密度在80%~90%左右，按照1:2或1:3繼續(xù)傳代培養(yǎng)。棕櫚酸鈉溶于DPBS（95℃助溶）配成20 mmol·L^-1溶液，將d-BSA按質(zhì)量/體積溶于DPBS(55℃助溶)配成20%d-BSA溶液，將棕櫚酸鈉趁熱加入到等體積的d-BSA中，配成10 mmol·L^-1的棕櫚酸鈉（含10%d-BSA）存儲(chǔ)液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/span>

2.2高糖高脂誘導(dǎo)細(xì)胞衰老模型建立及分組  高糖/高脂培養(yǎng)基模擬2型糖尿病狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)用不同濃度D-葡萄糖和棕櫚酸鈉誘導(dǎo)HAEC衰老，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞衰老染色檢測(cè)評(píng)估細(xì)胞衰老程度，篩選出高糖高脂誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的最佳造模濃度，然后用不同濃度人參-三七-川芎提取物處理細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為空白組別、模型組（40 mmol·L^-1葡萄糖+100 μmol·L^-1棕櫚酸鈉）和中藥低、中、高劑量組（50,100,200 mg·L^-1），藥物均用ECM完全培養(yǎng)基稀釋，干預(yù)48 h。

2.3指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 細(xì)胞增殖能力  本研究采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。細(xì)胞5×10³個(gè)/孔接種于96孔板，每組設(shè)立6個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，每組進(jìn)行相應(yīng)的處理，處理48 h后，向每孔內(nèi)加入CCK-8液10 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2~3 h，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度A。

2.3.2細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色  待測(cè)細(xì)胞以2×10⁴個(gè)/孔接種于24孔板中，細(xì)胞貼壁后，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用DPBS洗滌1次，每孔加入SA-β-gal 250 μL染色固定液，室溫固定15 min后，吸除細(xì)胞固定液，用DPBS洗滌細(xì)胞3次，每孔加入250 μL染色工作液，置于無CO₂的37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過夜。倒置光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，計(jì)算藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量占視野內(nèi)總細(xì)胞量的比例。

2.3.3 免疫熒光檢測(cè)  根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后,吸除培養(yǎng)液，DPBS清洗2遍,每次5 min，4%多聚甲醛常溫固定15 min，DPBS清洗3遍，每次5 min；再用0.1%Tritonx-100通透10 min，DPBS清洗3遍；加入5%BSA封閉液37 ℃封閉1 h；棄去封閉液后加入p-H2A.X一抗(1:500稀釋)，4 ℃過夜；次日用DPBS清洗3遍后，加入熒光標(biāo)記二抗（1:1 000稀釋），37 ℃避光孵育1 h；DPBS清洗3遍，加DAPI室溫孵育5 min；DPBS清洗3遍，加DPBS置于共聚焦顯微鏡下觀察。

2.3.4 線粒體ROS(mtROS)檢測(cè)  采用Mito SOX RED熒光染色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)mtROS水平。細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，DPBS清洗2遍，按照mtROS檢測(cè)說明書加入 Mito SOX RED 5 μmol·L^-1，37 ℃避光孵育10 min，DPBS清洗2遍，置于共聚焦顯微鏡下觀察。

2.3.5 線粒體膜電位(MMP)檢測(cè)  MMP檢測(cè)是以JC-1為熒光探針，能快速靈敏地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MMP變化。細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液和JC-1染色工作液，37 ℃避光孵育20 min，預(yù)冷的JC-1染色緩沖液洗滌2次，置于共聚焦顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。正常情況下，細(xì)胞的MMP較高，JC-1熒光探針聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；當(dāng)MMP降低時(shí)，JC-1熒光探針不能聚集在基質(zhì)中，不能形成聚合物，產(chǎn)生綠色熒光。

2.3.6 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)衰老相關(guān)蛋白p16，p21蛋白的表達(dá)按照RIPA蛋白抽提試劑說明提取各組總蛋白，經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白含量后調(diào)整蛋白濃度，加入5×SDS上樣緩沖液，99 ℃變性5 min；12%SDS-PAGE電泳后半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1h，1:2 000稀釋一抗4 ℃過夜；TBST清洗3次，每次5 min，1:3 000稀釋二抗后室溫孵育1 h；TBST清洗3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯示目的條帶。采用Image Lab圖像分析系統(tǒng)對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，并以β-actin為內(nèi)參照。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析  采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)值以`c±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.1對(duì)HAEC細(xì)胞增殖能力的影響  通過各組CCK-8檢測(cè)比較發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，高糖高脂干預(yù)48 h可明顯抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖（P<0.01）；與模型組比較，益氣活血藥可明顯促進(jìn)細(xì)胞的增殖，并且呈劑量依賴性升高（P<0.01）。見表1。

表 1  人參-三七-川芎提取物對(duì)HAEC細(xì)胞增殖能力的影響（`c±s,n=6）

Table 1  Effect of extract of Ginseng, Sanqi and Chuanxiong on HAECcell viability（`c±s,n=6）

注：與空白組別比較，¹⁾P<0.05，²⁾P<0.01；與模型組比較³⁾P﹤0.05，⁴⁾P﹤0.01(表2-3同)

3.2對(duì)HAEC細(xì)胞衰老SA-β-gal染色的影響  各組SA-β-gal細(xì)胞衰老染色比較，高糖高脂模型組SA-β-gal藍(lán)色染色比例顯著增加（P<0.01）；50，100，200 mg·L^-1人參-三七-川芎提取物處理后均可減低SA-β-gal藍(lán)色染色的陽性比例（P<0.01）。見圖1，表2。

A.空白組；B.模型組；C.人參-三七-川芎提取物低劑量組；D.人參-三七-川芎提取物中劑量組；E.人參-三七-川芎提取物高劑量組（圖2同）

圖 1  人參-三七-川芎提取物對(duì)HAEC細(xì)胞SA-β-gal染色的影響（SA-β-gal，×200）

Fig.1  Effect of extract of Ginseng, Sanqi and Chuanxiong on SA-β-gal staining of HAEC（SA-β-gal staining，×200）

表 2  益氣活血藥對(duì)HAEC SA-β-gal染色的影響（`c±s,n=3）

Table 2  Effect of extract of Ginseng, Sanqi and Chuanxiong on SA-β-gal staining of HAEC（`c±s,n=3）

3.3對(duì)HAEC衰老相關(guān)蛋白p16，p21的影響  與空白組比較，模型組HAEC p16，p21蛋白含量升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，益氣活血人參-三七-川芎提取物組中p16，p21蛋白表達(dá)含量明顯下降（P<0.05，P<0.01）。見圖2，表3。

圖 2  HAEC衰老相關(guān)蛋白p16，p21蛋白表達(dá)電泳

Fig.2  Electrophoresis of protein p16 and p21 of HAEC

表 3  人參-三七-川芎提取物對(duì)HAEC衰老相關(guān)蛋白p16，p21的影響（`c±s,n=4）

Table 3  Effect of extract of Ginseng, Sanqi and Chuanxiong on senescence-associated protein p16 and p21 of HAEC（`c±s,n=4）

3.4 對(duì)HAEC DNA雙鏈損傷的影響  為了進(jìn)一步探索高糖高脂誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的具體機(jī)制及人參-三七-川芎提取物的干預(yù)作用，本實(shí)驗(yàn)選擇益氣活血藥最佳劑量200 mg·L^-1進(jìn)行后續(xù)研究。H2A.X是DNA雙鏈損傷的生物標(biāo)記物，參與多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老過程。激光免疫共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，高糖高脂組內(nèi)p-H2A.X（Ser139）表達(dá)水平較正常組細(xì)胞增高；與模型組比較，益氣活血藥處理48h后，可明顯降低細(xì)胞內(nèi)p-H2A.X（Ser139）的水平。見圖3。 

A.空白組；B.模型組；C.人參-三七-川芎提取物組（200mg·L^-1）（圖4，5同）

圖 3  人參-三七-川芎提取物對(duì)HAEC DNA雙鏈損傷的影響

Fig.3  Effect of extract of Ginseng, Sanqi and Chuanxiong on double-stranded DNA of HAEC

3.5 對(duì)HAEC線粒體ROS和線粒體膜電位的影響  為了進(jìn)一步探索人參-三七-川芎提取物延緩高糖高脂誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老的機(jī)制，本研究檢測(cè)線粒體膜電位和mtROS的生成。結(jié)果顯示高糖高脂刺激可導(dǎo)致mtROS生成增加，人參-三七-川芎提取物干預(yù)后可減低細(xì)胞內(nèi)mtROS含量，見圖4；與正常組比較，模型組紅色熒光比例明顯下降，人參-三七-川芎提取物組紅/綠熒光比例升高，提示高糖高脂可降低線粒體膜電位水平，人參-三七-川芎提取物干預(yù)可提高線粒體膜電位水平，見圖5。

圖 4  人參-三七-川芎提取物對(duì)HAEC線粒體ROS的影響

Fig.4  Effect of extract of Ginseng, Sanqi and Chuanxiong on mitochondrial ROS of HAEC

圖 5  人參-三七-川芎提取物對(duì)HAEC線粒體膜電位的影響

Fig.5  Effect of extract of Ginseng, Sanqi and Chuanxiong on mitochondrial membrane potential of HAEC

     血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管系統(tǒng)與血液之間的重要屏障，通過合成和釋放多種活性物質(zhì)調(diào)節(jié)血管功能，在維持血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。越來越多證據(jù)表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老在內(nèi)皮功能失常及相關(guān)性血管疾病中發(fā)揮重要作用。糖尿病患者長(zhǎng)期處于糖脂代謝紊亂的狀態(tài)，高糖和高脂刺激可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞不斷分裂而進(jìn)入衰老期，造成血管內(nèi)皮完整性喪失和功能紊亂，促進(jìn)血管并發(fā)癥的形成。本研究采用葡萄糖聯(lián)合棕櫚酸共同處理HAEC細(xì)胞后，證實(shí)了高糖高脂環(huán)境可加速血管內(nèi)皮細(xì)胞的衰老進(jìn)程，表現(xiàn)在細(xì)胞增殖能力下降，SA-β-gal藍(lán)染比例增加和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p16和p21表達(dá)水平升高。

中醫(yī)理論認(rèn)為氣血是構(gòu)成人體的最基本物質(zhì)，是臟腑經(jīng)絡(luò)等組織器官進(jìn)行生理活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。氣血虛衰，血脈不通是衰老的危險(xiǎn)因素，如《靈樞·天年篇》曰:“血?dú)馓?，脈不通，真邪相攻，亂而相引，故中壽而盡也”，其認(rèn)為機(jī)體氣血旺盛，循環(huán)不息則健康長(zhǎng)壽，反之則早夭。中藥人參、三七、川芎屬于益氣活血中藥的范疇，在心腦血管疾病的中醫(yī)治療中被廣泛的應(yīng)用。三味中藥聯(lián)合應(yīng)用，則可達(dá)到益氣活血、通脈活絡(luò)、延年益壽的功效。本研究結(jié)果顯示，益氣活血藥各組均可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少SA-β-gal藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量，并降低p16和p21表達(dá)水平，提示益氣活血藥有效延緩高糖高脂誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老，可能為糖尿病及心血管并發(fā)癥的治療提供有效的方法。

研究表明，線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，諸多因素如鈣離子超載、氧化應(yīng)激過度、能量耗竭都會(huì)造成線粒體受損，加速細(xì)胞內(nèi)ROS的累積，過量的ROS能直接損傷DNA，使DNA鏈聚積、烷化斷裂，導(dǎo)致基因序列改變、基因突變，加速細(xì)胞的衰老。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，葡萄糖和棕櫚酸處理48h后，內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位水平下降，mtROS生成增加，并伴隨DNA雙鏈損傷的生物標(biāo)記物p-H2A.X表達(dá)的增加，表明高糖高脂刺激損傷了內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體，加速細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，造成了DNA損傷累積，成為誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老的主要原因。而與高脂高糖模型組比較，益氣活血藥組細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平升高，mtROS生成減少，p-H2A.X表達(dá)水平下降。以上結(jié)果提示，益氣活血藥可能是通過保護(hù)線粒體，減少ROS引起DNA的損傷累積，從而達(dá)到延緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用。

綜上所述,益氣活血中藥人參-三七-川芎提取物能夠延緩高糖高脂引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老，其機(jī)制可能與升高線粒體膜電位，減少ROS生成引起的DNA損傷累積有關(guān)，這為T2DM及心血管并發(fā)癥的治療提供新的治療思路。