豆豆寫(xiě)于19.1.16 

上次介紹了關(guān)于基因預(yù)測(cè)的知識(shí)（為什么要搞全基因組測(cè)序（一））
這次是第二部——基因功能注釋

背景

得到一個(gè)基因集以后，需要知道基因有哪些功能，參與哪些生物過(guò)程，只有理解了基因的功能以后，才能聯(lián)系起來(lái)基因型與表型。

繼人類基因組計(jì)劃（HGP）完成以后，找到了2萬(wàn)多個(gè)編碼蛋白基因，但是基因功能還未知，然后又有了ENCODE（Encyclopedia of DNA Elements）計(jì)劃，找到了400萬(wàn)個(gè)基因開(kāi)關(guān)，平均一個(gè)基因有約200個(gè)開(kāi)關(guān)，這是人類既有共性又有個(gè)性的基礎(chǔ)。ENCODE計(jì)劃使人類基因組不再是個(gè)”空殼“
https://www./

關(guān)于ENCODE計(jì)劃：https:///science/pq2nx8.html

簡(jiǎn)而言之，功能注釋就是預(yù)測(cè)蛋白序列的功能，是最基本的分析之一

功能注釋?xiě)?yīng)用場(chǎng)景

• 從頭拼接的基因組并做了結(jié)構(gòu)注釋，知道了哪些地方是外顯子，哪些是內(nèi)含子，接下來(lái)就是功能注釋，預(yù)測(cè)每一條基因編碼什么蛋白，并且蛋白是什么功能

• 無(wú)參轉(zhuǎn)錄組需要從頭拼接轉(zhuǎn)錄本，拼接的轉(zhuǎn)錄本功能需要做注釋

• 得到了差異表達(dá)基因，想做下富集分析，就必須要了解每個(gè)基因?qū)?yīng)哪個(gè)GO分類，也是需要進(jìn)行功能注釋

原理

基因不同于蛋白，不能通過(guò)結(jié)構(gòu)來(lái)預(yù)測(cè)功能，只能通過(guò)與已知基因功能數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)去推測(cè)。一般的數(shù)據(jù)庫(kù)包括了兩部分內(nèi)容：一是基因序列（核酸+氨基酸）FASTA格式；二是基因功能信息（可以寫(xiě)到FASTA的ID行中或者單獨(dú)放在一個(gè)文件中）

一般采用氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果去數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行過(guò)濾

這里看到，基因功能注釋主要依賴數(shù)據(jù)庫(kù)，如果數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有這個(gè)基因，那么就無(wú)法注釋。更可怕的是，數(shù)據(jù)庫(kù)中有錯(cuò)誤，就會(huì)進(jìn)行錯(cuò)誤注釋

比對(duì)的結(jié)果并不是百分之百完全比對(duì)的，那么怎么判斷氨基酸序列和數(shù)據(jù)庫(kù)的關(guān)系呢？比對(duì)到多少才能被接受？這里需要考慮比對(duì)長(zhǎng)度、比對(duì)分值、identity值等，過(guò)濾掉一部分人為認(rèn)定不滿足同源關(guān)系的序列。但是又有一個(gè)問(wèn)題，不同區(qū)域的基因會(huì)發(fā)生不同程度的突變，如果僅設(shè)置一個(gè)值進(jìn)行過(guò)濾——”一刀切“，這個(gè)結(jié)果還是有待優(yōu)化

另外，如果結(jié)果提示：Selenocysteine (U) at position ** replaced by X 說(shuō)明U氨基酸被替代成了X（當(dāng)然并不是錯(cuò)誤，可以忽略），因?yàn)樵赽lastp/tblastn的打分矩陣中不存在U和- 這兩個(gè)字符，替換成任意字符X就可以任意打分
https://www./p/111143/

基本流程

如果手頭僅僅有幾條蛋白序列想做下功能注釋，那么直接甩給uniprot/ncbi在線blast比對(duì)就可以了，但是我們這里說(shuō)的情況是成千上萬(wàn)條基因，肯定不能在線提交，那么怎么辦？

要進(jìn)行大量蛋白序列的功能注釋，需要包括：同源注釋、功能分類

同源注釋

• 基于相似性的注釋：就是將要研究的序列與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，將數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)相似性高的蛋白序列可以作為研究序列的功能，常用的是Nr、Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù) ，常用軟件是blast和diamond 【其中，blast速度很慢，比對(duì)幾萬(wàn)條序列可能好幾天甚至一周；diamond也是基于blast但速度最快達(dá)到blast的兩萬(wàn)倍，準(zhǔn)確性差不多，因此一般就使用diamond就好】

blast是基于動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法，就是將每個(gè)位點(diǎn)都進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)上就得分，比對(duì)失敗就罰分。從準(zhǔn)確性講是不錯(cuò)的，但是這個(gè)方法對(duì)于背后的生物學(xué)特性欠缺考慮。因?yàn)椴皇敲總€(gè)氨基酸都是一樣重要的，對(duì)于某些抗性基因或者轉(zhuǎn)錄因子，真正起作用的往往是一些保守結(jié)構(gòu)域

• 基于結(jié)構(gòu)域的注釋：Pfam（https://pfam./）數(shù)據(jù)庫(kù)中有各種基因家族的保守域模型，可以用HMMER軟件將研究序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的模型進(jìn)行比對(duì)，如果序列上存在某個(gè)結(jié)構(gòu)域，那么推測(cè)序列含有該結(jié)構(gòu)域功能；另外Interpro（https://www./interpro/）是一個(gè)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)，使用interproscan軟件比對(duì)

做完同源注釋，就知道了研究的序列和數(shù)據(jù)庫(kù)中的哪個(gè)蛋白最相似，我們主要利用了nr、uniprot、pfam、interpro這些蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，它們又和下游的GO、KEGG、COG等分類數(shù)據(jù)庫(kù)有關(guān)聯(lián)，然后就能知道研究的蛋白屬于哪個(gè)GO分類，哪個(gè)Pathway，哪個(gè)基因家族，就是功能分類

功能分類

只了解單個(gè)基因的功能是不夠的，因?yàn)榛蜷g是相互作用、協(xié)同完成生物功能的，所有需要進(jìn)行分類，這就是在RNA-seq中得到差異表達(dá)基因后做的功能分類（GO）和富集分析（KEGG）過(guò)程，看看基因是不是協(xié)同完成某一個(gè)生物過(guò)程，它的原理與功能注釋相似，也是利用已有的分類去推測(cè)未知的分類

小Tip：功能注釋相當(dāng)于一個(gè)過(guò)濾篩。GO 注釋=》粗篩；KEGG=》細(xì)篩，例如：某一個(gè)蛋白，GO 只能將它注釋到與細(xì)胞凋亡有關(guān)；而 KEGG 則可以將它注釋到細(xì)胞凋亡通路中的某一個(gè)環(huán)節(jié)

例如COG數(shù)據(jù)庫(kù)（Cluster of Orthologous Groups of proteins， https://www.ncbi.nlm./COG/）是細(xì)菌、藻類和真核生物的21個(gè)完整基因組的編碼蛋白，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分類得來(lái)的。

ftp://ftp.ncbi./pub/COG/COG 數(shù)據(jù)庫(kù)還是2003年的，所以做出來(lái)的東西，看看就好了

參考：http://yk./myblog/cog%E5%88%86%E6%9E%90/

又例如GO數(shù)據(jù)庫(kù) ，其中每個(gè)注釋都是對(duì)基因產(chǎn)物的描述，有特定的分子功能（MF），涉及到特定的生物過(guò)程（BP），作用在特定的細(xì)胞組分（CC）。它把所有候選的靶基因向GO的各個(gè)term進(jìn)行映射，然后計(jì)算映射到每個(gè)term的靶基因數(shù)量，在整個(gè)參考基因背景中利用超幾何分布檢驗(yàn)，選出候選靶標(biāo)基因中顯著富集的GOterm

再例如KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，關(guān)于生物化學(xué)途徑的描述，許多活細(xì)胞的功能不能僅僅依賴于單個(gè)基因，它將基因組信息與更高一級(jí)的功能信息結(jié)合；另外它可以將基因組中的許多基因利用細(xì)胞內(nèi)分子互作網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系起來(lái)，通過(guò)通路或者復(fù)合物來(lái)展示更高級(jí)的生物學(xué)功能

下次介紹整合的流程軟件