談?wù)摰街毕低椿蚍治龅臅r候，大部分教程都是介紹OrthoMCL，這是2003年發(fā)表的一個工具，目前的引用次數(shù)已經(jīng)達到了3000多，但這個軟件似乎在2013年之后就不在更新，而且安裝時還需要用到MySQL（GitHub上有人嘗試從MySQL轉(zhuǎn)到sqlite）。

而OrthoFinder則是2015年出現(xiàn)的軟件，目前已有400多引用。該軟件持續(xù)更新，安裝更加友好，因此我決定使用它來做直系同源基因的相關(guān)分析。

OrthoFinder能做什么？

OrthoFinder: solving fundamental biases in whole genome comparisons dramatically improves orthogroup inference accuracy提到，它的優(yōu)點就是比其他的直系同源基因組的推斷軟件準(zhǔn)確，并且速度還快。

此外他還能分析所提供物種的系統(tǒng)發(fā)育樹，將基因樹中的基因重復(fù)事件映射到物種樹的分支上，還提供了一些比較基因組學(xué)中的統(tǒng)計結(jié)果。

OrthoFinder的分析過程

OrthoFinder的分析過程分為如下幾步:

1. BLAST all-vs-all搜索。使用BLASTP以evalue=10e-3進行搜索，尋找潛在的同源基因。(除了BLAST, 還可以選擇DIAMOND和MMSeq2)

2. 基于基因長度和系統(tǒng)發(fā)育距離對BLAST bit得分進行標(biāo)準(zhǔn)化。

3. 使用RBNHs確定同源組序列性相似度的閾值

4. 構(gòu)建直系同源組圖(orthogroup graph)，用作MCL的輸入

5. 使用MCL對基因進行聚類，劃分直系同源組

OrthoFinder2在OrthoFinder的基礎(chǔ)上增加了物種系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，流程如下

1. 為每個直系同源組構(gòu)建基因系統(tǒng)發(fā)育樹

2. 使用STAG算法從無根基因樹上構(gòu)建無根物種樹

3. 使用STRIDE算法構(gòu)建有根物種樹

4. 有根物種樹進一步輔助構(gòu)建有根基因樹

基于Duplication-Loss-Coalescent 模型，有根基因樹可以用來推斷物種形成和基因復(fù)制事件，最后記錄在統(tǒng)計信息中。

軟件使用

在解壓縮的OrthoFinder文件目錄下(安裝見最后)有一個 ExampleData, 里面就是用于測試的數(shù)據(jù)集。

OrthoFinder的基本使用就是如此簡單，而且最終效果也基本符合需求。

如果你想根據(jù)多序列聯(lián)配(MSA)結(jié)果按照極大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，那么你需要加上 -M msa。這樣結(jié)果會更加準(zhǔn)確，但是代價就是運行時間會更久，這是因為 OrthoFinder要做10,000 - 20,000個基因樹的推斷。

OrthoFinder默認(rèn)用mafft進行多序列聯(lián)配，用fasttree進行進化樹推斷。多序列聯(lián)配軟件還支持muscle, 進化樹推斷軟件還支持iqtree, raxml-ng, raxml。例如參數(shù)可以設(shè)置為 -M msa-A mafft-T raxml.

并行化參數(shù): -t參數(shù)指定序列搜索時的線程數(shù)， -a指的是序列搜索后分析的CPU數(shù)。

軟件細(xì)節(jié)

OrthoFinder提供了 config.json可以調(diào)整不同軟件的參數(shù)，如下是BLASTP。

OrthoFinder默認(rèn)使用 DendroBLAST發(fā)育樹，也就是根據(jù)序列相似度推斷進化關(guān)系。這是作者推薦的方法，在損失部分準(zhǔn)確性的前提下提高了運算效率。當(dāng)然你可以用 -M msa從多序列比對的基礎(chǔ)上進行基因樹構(gòu)建。如果你先用了默認(rèn)的 DendroBLAST，想測試下傳統(tǒng)的MSA方法，那么也不需要重頭運行，因為有一個 -b參數(shù)可以在復(fù)用之前的比對結(jié)果。

在物種發(fā)育樹的推斷上，OrthoFinder使用STAG算法，利用所有進行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，而非單拷貝基因。此外當(dāng)使用MSA方法進行系統(tǒng)發(fā)育樹推斷時，OrthoFinder為了保證有足夠多的基因(大于100)用于分析，除了使用單拷貝基因外，還會挑選大部分是單拷貝基因的直系同源組。這些直系同源組的基因前后相連，用空缺字符表示缺失的基因，如果某一列存在多余50%的空缺字符，那么該列被剔除。最后基于用戶指定的建樹軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。結(jié)果在'WorkingDirectory/SpeciesTree_unrooted.txt'

使用STRIDE算法從無根樹中推斷出有根樹, 結(jié)果就是'SpeciesTree_rooted.txt'.

結(jié)果文件

運行結(jié)束后，會在 ExampleData里多出一個文件夾， Results_Feb14, 其中Feb14是我運行的日期

直系同源組相關(guān)結(jié)果文件，將不同的直系同源基因進行分組

• Orthogroups.csv：用制表符分隔的文件，每一行是直系同源基因組對應(yīng)的基因。

• Orthogroups.txt: 類似于Orthogroups.csv，只不過是OrhtoMCL的輸出格式

• Orthogroups_UnassignedGenes.csv: 格式同Orthogroups.csv，只不過是物種特異性的基因

• Orthogroups.GeneCount.csv：格式同Orthogroups.csv, 只不過不再是基因名信息，而是以基因數(shù)。

直系同源相關(guān)文件，分析每個直系同源基因組里的直系同源基因之間關(guān)系，結(jié)果會在 Orthologues_Feb14文件夾下，其中 Feb14是日期

• Gene_Trees: 每個直系同源基因基因組里的基因樹

• ReconGeneTrees：使用OrthoFinder duplication-loss coalescent 模型進行發(fā)育樹推斷

• PotentialRootedSpecies_Trees: 可能的有根物種樹

• SpeciesTree_rooted.txt: 從所有包含STAG支持的直系同源組推斷的STAG物種樹

• SpeciesTreerootednode_labels.txt: 同上，只不過多了一個標(biāo)簽信息，用于解釋基因重復(fù)數(shù)據(jù)。

比較基因組學(xué)的相關(guān)結(jié)果文件：

• Orthogroups_SpeciesOverlaps.csv： 不同物種間的同源基因的交集

• SingleCopyOrthogroups.txt： 單基因拷貝組的編號

• Statistics_Overall.csv：總體統(tǒng)計信息

• Statistics_PerSpecies.csv：分物種統(tǒng)計信息

STAG是一種從所有基因推測物種樹的算法，不同于使用單拷貝的直系同源基因進行進化樹構(gòu)建。

一些重要概念:

• Species-specific orthogroup: 一個僅來源于一個物種的直系同源組

• Single-copy orthogroup: 在直系同源組中，每個物種里面只有一個基因。我們會用單拷貝直系同源組里的基因推斷物種樹以及其他數(shù)據(jù)分析。

• Unassigned gene: 無法和其他基因進行聚類的基因。

• G50和O50，指的是當(dāng)你直系同源組按照基因數(shù)從大到小進行排列，然后累加，當(dāng)加入某個組后，累計基因數(shù)大于50%的總基因數(shù)，那么所需要的直系同源組的數(shù)目就是O50，該組的基因樹就是G50.

Orthogroups, Orthologs 和 Paralogs 這三個概念推薦看圖理解。

如何安裝？

最快的方法

OrthoFinder可以通過conda安裝，建議為它新建一個虛擬環(huán)境

conda create -n orthofinder orthofinder=2.2.7

如果你愿意折騰

你先得安裝它的三個依賴工具: MCL, FastME, DIAMOND/MMseqs2/BLAST+

MCL有兩種安裝方式，最簡單的就是用 sudo pat-getinstall mcl, 但是對于大部分人可能沒有root權(quán)限，因此這里用源代碼編譯。http:///mcl/

之后是MMseqs2, 一個蛋白搜索和聚類工具集，相關(guān)文章發(fā)表在NBT, NC上。GitHub地址為https://github.com/soedinglab/MMseqs2

wget https://github.com/soedinglab/MMseqs2/releases/download/3-be8f6/MMseqs2-Linux-AVX2.tar.gz
tar xzf MMseqs2-Linux-AVX2.tar.gz
mv mmseqs2 ~/opt/biosoft/

最后安裝FastME, 這是一個基于距離的系統(tǒng)發(fā)育樹推斷軟件。在http://www./fastme/binaries.php下載，上傳到服務(wù)器