?  基因轉(zhuǎn)移

基因轉(zhuǎn)移指應(yīng)用物理、 化學(xué)或生物學(xué)方法將目的基因轉(zhuǎn)移入受體細(xì)胞內(nèi)的過程?；蜣D(zhuǎn)移技術(shù)在基因工程、生物醫(yī)學(xué)研究、基因治療、植物農(nóng)作物品種改 造等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。通過基因轉(zhuǎn)移將遺傳信息從一個基因組向另一個基因組轉(zhuǎn)移，使 轉(zhuǎn)移的遺傳信息在受者生物表達(dá)。（李英碧）[1]

中文名

基因轉(zhuǎn)移

方向

橫向和縱向

本質(zhì)

蛋白質(zhì)

領(lǐng)域

生物學(xué)

簡介

最常用的將克隆重組的DNA片段導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的方法是用磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染的DNA可能是通過吞飲作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后進(jìn)行細(xì)胞核。

轉(zhuǎn)移方法

基因轉(zhuǎn)移是用物理的、化學(xué)的或生物學(xué)的方法將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并使之表達(dá)的一種技術(shù)。

物理方法

包括顯微鏡注射法、電脈沖介導(dǎo)法。顯微注射法是應(yīng)用特別的玻璃顯微注射器在顯微鏡下把重組DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞；電脈沖介導(dǎo)法又稱電穿孔法，是指在高壓電脈沖的作用下，使細(xì)胞膜上出現(xiàn)瞬間微小的孔洞，從而介導(dǎo)不同細(xì)胞之間的原生質(zhì)膜發(fā)生融合，使外源DNA通過細(xì)膜上出現(xiàn)的瞬間小孔而進(jìn)入細(xì)胞。

化學(xué)方法

有DNA-陽離子-二甲基亞砜法?；蜣D(zhuǎn)移的生物學(xué)方法包括細(xì)胞融合法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、原生質(zhì)體融合法等。除以上三種方法外，又出現(xiàn)了顆粒轟擊技術(shù)，就是將外源DNA包被在金屬上，在電場中包被DNA的金屬顆粒獲得能量并以高速度運動，穿入靶細(xì)胞組織或器官內(nèi)，由于這種金屬顆?？梢酝砍杀∧?，所以可實現(xiàn)較多細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移同時發(fā)生，改進(jìn)了其它物理方法基因轉(zhuǎn)移效率低的缺點。

盡管物理法、化學(xué)法及生物學(xué)法在基因轉(zhuǎn)移中被廣泛應(yīng)用，但由于基因轉(zhuǎn)移效率較低，在短時間內(nèi)難以取得基因治療所需要的108~1012個轉(zhuǎn)化細(xì)胞，因而在基因治療的應(yīng)用中仍然具有一定局限性，雖然對其進(jìn)行了一些改造，如顆粒轟擊技術(shù)的處理和應(yīng)用，但也不能完全克服以上缺點，故而在基因治療中不得不救助于其它技術(shù)，目前被廣泛應(yīng)用的一種技術(shù)就是逆轉(zhuǎn)病毒載體技術(shù)（RMGT）。

逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因技術(shù)

是目前將外源基因?qū)爰?xì)胞的最有效的方法。此系統(tǒng)包括重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和包裝細(xì)胞兩個部分，廣泛應(yīng)用的逆病毒載體LNL6是以Moloney鼠白血病病毒（MO-MLV）改建的。該病毒為RNA病毒，感染細(xì)胞后，其基因組RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)產(chǎn)生雙鏈DNA拷貝插入宿主染色體形成前病毒，前病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生正鏈即為病毒基因組RNA。整個基因組從5′端到3′端依次是：5′長末端重復(fù)順序（LTR）編碼病毒內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白的gag基因，編碼蛋白的pol基因，編碼外殼蛋白的env基因以及3′LTR和一個介子5′LTR和gag基因之間的包裝信號。將病毒蛋白編碼區(qū)gag、pol、env全部切除，代之以外源性目的基因即改建為病毒載體，保留了LTR和包裝信號，是一種復(fù)制缺陷性病毒。同時，設(shè)計一種包裝細(xì)胞系，其內(nèi)含有輔助病毒基因組，即為包裝信號缺乏的MO-MLV。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)入包裝細(xì)胞系時，載體基因就被包裝形成完整的病毒顆粒，于是包裝細(xì)胞系就成了制造病毒載體的生產(chǎn)細(xì)胞系。將靶細(xì)胞與生產(chǎn)細(xì)胞系其同培養(yǎng)或是收集含有載體病毒的生產(chǎn)細(xì)胞系上清液與靶細(xì)胞一起孵育，即可有效地進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體技術(shù)的優(yōu)點在于轉(zhuǎn)染譜廣，可感染包括人體在內(nèi)的多種動物細(xì)胞類型，一次可感染大量細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率高達(dá)100%，轉(zhuǎn)染的基因可為單拷貝和少數(shù)拷貝，能準(zhǔn)確地整合到宿主細(xì)胞基因組中，整合率高，且能長期有效地表達(dá)。

RMGT仍有不足之處

①載體的滴度較低；

②是輔助病毒與載體病毒重組重新獲得包裝信號使病人面臨感染輔助病毒的危險性；

③此載體只能整合至分裂相細(xì)胞；

④此載體容納的外源基因量較少，不利于較大的基因的插入。

因此，人們在努力改造包裝細(xì)胞系使其日趨完善，并廣泛用于體外及體內(nèi)的基因治療中。在體外治療中，為了增強腫瘤病人骨髓細(xì)胞對化療藥物的敏感性，將骨髓細(xì)胞和帶有mdrI基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒在體外共同培養(yǎng)后回輸體內(nèi)，獲得了很高的療效；在體內(nèi)治療中，用HSV-tk基因構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染成纖維細(xì)胞后被直接注入鼠腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，再給予GCV治療，轉(zhuǎn)染了HSV-TK基因的膠質(zhì)瘤細(xì)胞對GCV的易感性使得腫瘤完全消退了，目前，這項實驗的臨床應(yīng)用階段尚未報道。

轉(zhuǎn)移步驟

（1）配制下列溶液

①2×HEPES-緩沖鹽溶液（HBS）

②2mol/L CaCl2

③0.1×TE(pH8.0)用0.22μm濾器過濾除菌，分裝貯存于4℃。

④DNA：將DNA（約20μg/106細(xì)胞）溶于0.1×TE（pH8.0），使用濃度為40μg/ml。為使轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，質(zhì)粒DNA應(yīng)用CsCl-溴化乙錠密度梯度平衡離心法純化。如果所用DNA量較少，應(yīng)加入載體DNA將DNA濃度調(diào)至40μg/ml。實驗室制備的真核載體DNA轉(zhuǎn)染效率通常要比商品化的牛胸腺DNA、鮭魚精DNA高。載體DNA用前應(yīng)通過乙醇沉淀或氯仿抽提進(jìn)行滅菌。

（2）轉(zhuǎn)染前24h用胰蛋白酶進(jìn)行消化以獲得對數(shù)生長期的細(xì)胞，以1～2×105細(xì)胞/cm2的密度重新種入60mm組織培養(yǎng)皿中。在37℃、5%～7%CO2及一定濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24h。

（3）每轉(zhuǎn)染一個60mm培養(yǎng)皿中的單層細(xì)胞，須依如下方法制備磷酸鈣-DNA共沉淀物：取步驟一所制備的DNA[40μg/ml，溶于0.1×TE(pH8.0)]220μl,2×HBs 250μl,放入一次性使用的滅菌5ml塑料管中，緩慢加入31μl 2mol/l 氯化鈣（溫和混合30s左右）。于室溫育20～30min，其間將形成細(xì)小沉淀。溫育結(jié)束時，用吸管將混合液吹打一次，使沉淀物懸浮。

通常采用的另一方案是將氯化鈣和DNA的稀釋混合液加入2×HBS溶液中，逐滴加入并小心混合250μl按步驟一制備并溶于氯化鈣（250mmol/L）的DNA。按照前述方法溫育之。

如果需要轉(zhuǎn)染更為大量的細(xì)胞，上述兩種反應(yīng)混合液的體積均可翻一番或翻兩番。如果體積翻兩番，則須使用更大的塑料管，一般在25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上，可將0.5ml磷酸鈣-DNA共沉淀物加入5ml培養(yǎng)液中，而在90mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上，一般將1ml沉淀物加入10ml培養(yǎng)液中。

已經(jīng)發(fā)表的方案中，混合各組分的方式與速率大不相同。其中有一些認(rèn)為除了溫和振搖之外，其它措施均無濟(jì)于事，并建議用電動移液裝置吹出的空氣來混合溶液。其它一些方案則規(guī)勸在加入DNA溶液時連續(xù)而緩慢地混勻，然后再溫和振蕩。其目的是為了避免急速形成粗沉淀物，以致降低轉(zhuǎn)化效率。實際上，除了混合的速度之外，還有其它若干因素包括DNA的濃度和大小（讓高分子量DNA從細(xì)針頭中通過，可將之剪切變?。⒕彌_液的精確pH（有些工作者配制了幾批pH范圍從6.95至7.1不等的HBS緩沖液，逐批試驗沉淀物的質(zhì)量及轉(zhuǎn)染效率）。如果必須使轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高，就要花時間針對特定的系統(tǒng)優(yōu)化上述幾種因素。一旦得到一批靈驗的試劑，只需依照前面方法進(jìn)行配制和貯存，即可在長期內(nèi)獲得可重復(fù)的結(jié)果。

（4）將磷酸鈣-DNA懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞單層上的培養(yǎng)液中[在60mm培養(yǎng)皿中，可將0.5ml懸液加入5ml培養(yǎng)液中]，輕輕左右晃動一下培養(yǎng)皿使培養(yǎng)液得以混合，此時可見培養(yǎng)液成黃橙色渾濁狀。另一方法是吸出培養(yǎng)液，直接把沉淀物加到細(xì)胞上，將細(xì)胞置于室溫溫育15min，然后再將培養(yǎng)液加回到培養(yǎng)皿中，此時細(xì)胞上有許多細(xì)小顆粒。采用以上兩種方法，都要在37℃、5%～7%CO2及一定濕度的培養(yǎng)箱中將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)長達(dá)24h[時間的長短取決于后續(xù)處理步驟的不同，見步驟（5）]。

（5）然后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞可依以下任一種方法處理：

①如果不進(jìn)行其它處理（如用氯喹、甘油或丁酸鈉等試劑處理，見后），可在細(xì)胞培養(yǎng)16～24h后，吸出培養(yǎng)液和沉淀物，用PBS將單層細(xì)胞再洗一次。然后按下述③d操作。

②在許多情況下，同時用氯喹處理細(xì)胞，可提高DNA攝入率。氯喹可能是通過抑制溶酶體水解酶類對DNA的降解而起作用的。氯喹濃度及其處理時間不能超越細(xì)胞對其毒性作用的耐受能力。因此必須通過預(yù)實驗來決定適于所用特定型別細(xì)胞的最佳氯喹濃度。但對于大部分型別的細(xì)胞，用終濃度為100μmol/L的氯喹處理3～5h，都可取得良好效果?？稍诹姿徕}-DNA共沉淀物加入細(xì)胞之前或之后（見步驟（4）介紹的其它方法），直接將氯喹二磷酸貯存液（過濾除菌并貯于-20℃用金屬泊密封的管中，100mmol/L）稀釋（1：100）于培養(yǎng)液中。在氯喹處理過程中，細(xì)胞呈現(xiàn)泡狀是正常的。經(jīng)用DNA和氯喹處理3～5h后，棄去培養(yǎng)液和沉淀，用PBS洗，然后按下述d操作。

③用甘油短暫處理細(xì)胞，同樣可提高轉(zhuǎn)化效率或?qū)隓NA的瞬時表達(dá)水平。這一步驟可以在氯喹處理之后進(jìn)行。由于不同細(xì)胞對甘油的毒性作用的敏感性相差懸殊，因此每種型別的細(xì)胞都必須通過預(yù)實驗決定最佳處理時間（從30s至3min）。耐受甘油的細(xì)胞可以暴露于含磷酸鈣-DNA共沉淀物（含或不含氯喹）的生長液3～5h后進(jìn)行休克。

a. 吸出生長液，用PBS將單層細(xì)胞洗1次

b.在單層細(xì)胞中加入1.5ml溶于1×HBS的15%甘油，在37℃培養(yǎng)0.5～3min

c.吸出甘油，用PBS將單層細(xì)胞洗1次

d.加入5ml預(yù)加溫的完全生長液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24～60h后，檢測DNA的瞬時表達(dá)或?qū)⒓?xì)胞重新種入適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基中，分離穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。

④業(yè)以表明，丁酸鈉也可以在猴源和人源細(xì)胞中增強帶SV40早期啟動子/增強子的重組質(zhì)粒的表達(dá)?？芍苯釉谏L液中加入有關(guān)試劑，也可以使經(jīng)過甘油休克的細(xì)胞接受丁酸鈉處理。須視細(xì)胞型別的不同，采用不同濃度的丁酸鈉（500mmol/L貯存液，在化學(xué)通風(fēng)櫥中用NaOH中和丁酸制備而成），例如：

CV-1　10mmol/L

NIH-3T3　7mmol/L

HelaS3　5mmol/L

CHO 　2mmo