與批次和補料分批培養(yǎng)不同，連續(xù)細胞培養(yǎng)通過補充新鮮培養(yǎng)基，同時去除耗竭培養(yǎng)基，維持生物反應器內(nèi)恒定的體積，通?？蛇_到極高的細胞密度，這就意味著培養(yǎng)基灌流速率高于細胞生產(chǎn)速率，細胞需被截留在生物反應器內(nèi)。目前市面上有不同類型的細胞截留裝置。但是，最常使用的是切向流過濾（TFF）或交替式切向流（ATF）。

早在80年代后期和90年代初，連續(xù)培養(yǎng)已被考慮用于生物制藥，彼時，連續(xù)生產(chǎn)主要用于生產(chǎn)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。但隨著對生物藥需求的增加以及市場競爭的加劇，行業(yè)開始尋求更高效、更靈活的工藝和設施。為解決這種新的挑戰(zhàn)，制藥行業(yè)開始重新審視連續(xù)培養(yǎng)作為一種解決方案的可能性。

使用配置交替式切向流（ATF）過濾的攪拌罐生物反應器進行灌流培養(yǎng)，以進行病毒顆粒連續(xù)生產(chǎn)時的反應器配置（S.Gutierrez-Granados, et al. 2018）。

盡管連續(xù)培養(yǎng)的操作更加復雜，但與批次和補料分批相比，其優(yōu)勢也非常明顯。連續(xù)補加培養(yǎng)基可獲得更高的細胞密度。與此同時，可能會影響細胞生長或蛋白質(zhì)生產(chǎn)的代謝副產(chǎn)物被連續(xù)去除。這通?？赊D化成更高的單位體積產(chǎn)量，相應地降低生物反應器尺寸、降低生產(chǎn)線占地以及成本投入，而生產(chǎn)批次的大小由操作時間決定，而不是生物反應器的大小。產(chǎn)物可連續(xù)收獲，這對于不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)來說是一項明顯的優(yōu)勢，因如其在生物反應器滯留時間過長，可能因為培養(yǎng)的條件，而損失其質(zhì)量屬性?？傮w來說，相比其它培養(yǎng)模式，連續(xù)培養(yǎng)可強化工藝，增強操作的靈活性，而降低成本。

過去一段時間，連續(xù)培養(yǎng)在蛋白質(zhì)和單克隆抗體生產(chǎn)上的應用已經(jīng)得到了很大的發(fā)展，而參考原文關注了使用連續(xù)培養(yǎng)進行病毒（疫苗和病毒載體）的生產(chǎn)，以及這種培養(yǎng)模式怎樣操作和優(yōu)化，以提高基于細胞培養(yǎng)的病毒性產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量。

病毒性疫苗的連續(xù)生產(chǎn)

基于細胞培養(yǎng)的病毒性疫苗包括相對“經(jīng)典”的減毒和滅活病毒以及新一代的非感染性病毒樣顆粒（VLP）。這種多樣性也反映在其生產(chǎn)方法：一些疫苗通過感染宿主細胞生產(chǎn)，而另一些使用穩(wěn)定或瞬時異源性蛋白質(zhì)表達方法生產(chǎn)。不管哪種方法，都需要克服相應的生產(chǎn)挑戰(zhàn)，包括提高滴度、獲得更加經(jīng)濟的工藝，以及保證產(chǎn)物質(zhì)量，后者會直接影響疫苗免疫源性和安全性。

常見生產(chǎn)方式（瞬時轉染、病毒感染及穩(wěn)定細胞系）示意圖（S.Gutierrez-Granados, et al. 2018）。

連續(xù)培養(yǎng)為基于細胞的病毒性疫苗生產(chǎn)工藝的優(yōu)化提供了解決方案。已有關于不同連續(xù)培養(yǎng)方法的報導。

用于疫苗生產(chǎn)的灌流培養(yǎng)

與重組蛋白和單克隆抗體不同的是，病毒結構的復雜性妨礙了宿主細胞生產(chǎn)大量病毒的能力，所以，細胞特異性病毒產(chǎn)率通常較低。出于此原因，為細胞連續(xù)提供新鮮的營養(yǎng)物質(zhì)，同時去除代謝副產(chǎn)物，有助于提高細胞所能生產(chǎn)的病毒數(shù)量。Nikolay等在批次搖瓶中以BHK-21懸浮細胞生產(chǎn)寨卡病毒，比使用貼壁Vero細胞的標準生產(chǎn)，產(chǎn)率要低（9x10^3 PFU/mL vs. ~10^7PFU/mL）。為提高滴度，作者使用ATF系統(tǒng)進行了灌流培養(yǎng)。感染前，通過將灌流速率從0.15VVD提升至0.42VVD，細胞生長至12x10^6cells/mL。感染后，灌流維持6天，達到3.9x10^7PFU/mL的生產(chǎn)結果。盡管相比貼壁細胞培養(yǎng)，懸浮細胞的特異性病毒產(chǎn)率仍較低，但是建立了一種用于寨卡病毒的產(chǎn)量足夠的可放大生產(chǎn)工藝。

Cervera等開發(fā)了一種可強化人免疫缺陷病毒（HIV）VLP生產(chǎn)的新方法，使用重復瞬時轉染和培養(yǎng)基置換的HEK293細胞培養(yǎng)，命名為Extended Gene Expression（EGE）。轉染后，每48小時置換培養(yǎng)基，相比72小時的批次培養(yǎng)，蛋白質(zhì)生產(chǎn)可提高8倍。而結合兩次再轉染，可提高12倍。在配有灌流的1.3L生物反應器上成功操作了這種方法，以0.5VVD的速率置換培養(yǎng)基，使用連續(xù)灌流，細胞可生長至更高的細胞密度（~16x10^6cells/mL），高于使用不連續(xù)培養(yǎng)基置換的搖瓶培養(yǎng)，同時維持VLP滴度。所以，EGE是一種可強化瞬時轉染工藝的非常有潛力的策略，可進一步優(yōu)化以獲得更高的VLP滴度。

Fontana等使用穩(wěn)定的HEK293細胞系生產(chǎn)了狂犬病毒樣顆粒。作者使用5L生物反應器，以灌流模式，培養(yǎng)細胞20天，使用旋轉濾器截留細胞。使用這種方法，培養(yǎng)密度可達到16x10^6cells/mL，相比批次模式，細胞密度翻倍。由于基于VLP的疫苗可穩(wěn)定生產(chǎn)，生物反應器內(nèi)細胞越多，即直接意味著可生產(chǎn)更多的產(chǎn)物。這可降低生產(chǎn)工藝的成本，進而顯著影響動物疫苗的生產(chǎn)。

通過灌流克服細胞密度效應

細胞密度效應是一種廣泛報導的現(xiàn)象，即細胞在高密度（0.5-5x10^6cells/mL以上，取決于每種特定的細胞系）條件下感染或轉染時，細胞特異性產(chǎn)率會顯著降低。造成這種現(xiàn)象的主要假設是在高密度條件下，營養(yǎng)物質(zhì)被“剝奪”，在此類條件下，細胞很難生產(chǎn)高病毒滴度。灌流已被證實有助于客服“細胞密度效應”的限制：以灌流模式培養(yǎng)的細胞在更高的細胞密度條件下被感染或轉染，可維持細胞特異性產(chǎn)率。

Genzel等通過感染AGE和CAP細胞生產(chǎn)流感病毒，以ATF系統(tǒng)進行灌流。AGE細胞在50x10^6cells/mL條件下感染，CAP細胞在25x10^6cells/mL條件下感染，相比低細胞密度感染，兩種情況均可維持特異性病毒產(chǎn)率，明顯克服了細胞密度效應。Petiot等報導感染使用聲學過濾器灌流培養(yǎng)的HEK293細胞，生產(chǎn)流感病毒。HEK293細胞在灌流中呈現(xiàn)中更加活躍的代謝狀態(tài)，從而使滴度增加10倍。Venereo-Sanchez等使用生產(chǎn)血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的可誘導細胞系生產(chǎn)基于VLP的流感疫苗，瞬時轉染Gag-GFP作為VLP的核蛋白。通過灌流培養(yǎng)HEK293細胞，以在誘導HA和NA表達及Gag轉染前，達到高細胞密度（14x10^6cells/mL）。由于特異性病毒產(chǎn)量不受影響，相比批次培養(yǎng)，灌流培養(yǎng)的Gag-GFP和HA滴度分別增加了60倍和17倍。

病毒性疫苗的連續(xù)收獲

基于病毒的疫苗滴度也會受到收獲時間的影響。病毒通常對生物反應器內(nèi)的理化狀態(tài)較為敏感，如果滯留時間過長，可能會影響其感染性。出于這個原因，如果病毒可被連續(xù)收獲，即可被立即處理或儲存于適合的條件下，以維持其特性。Petiot等對不同溫度條件下的流感病毒的穩(wěn)定性進行了研究，觀察到，如果生產(chǎn)在35℃條件下進行，且病毒連續(xù)收獲，并儲存于2-8℃，滅活率會顯著低于在37℃條件下進行的更長時間的培養(yǎng)。此外，細胞培養(yǎng)基的連續(xù)去除可避免細胞副產(chǎn)物（宿主細胞DNA和蛋白質(zhì)）的累積，有利于病毒特性的保持，也可簡化下游工藝。

用于疫苗生產(chǎn)的其它類型的連續(xù)培養(yǎng)

兩階段連續(xù)生物反應器是以連續(xù)模式生產(chǎn)病毒的另一種替代方法。該系統(tǒng)由物理性分離的兩個串聯(lián)生物反應器組成，一個用于細胞生長，一個用于病毒生產(chǎn)階段。詳細介紹，請參考原文。

病毒載體的連續(xù)生產(chǎn)

盡管過去幾年對病毒載體的興趣在不斷增加，但對生產(chǎn)工藝的關注卻不多。需要開發(fā)高效、可放大、穩(wěn)健且可重復的生產(chǎn)工藝，以滿足基因治療行業(yè)對病毒載體不斷增加的需求，同時保證合理的成本。最常使用的系統(tǒng)仍然是批次或補料分批，且多數(shù)基于貼壁細胞。但是，為克服這些策略的限制，灌流受到了越來越多的關注。病毒載體可通過感染、瞬時轉染或生產(chǎn)細胞系生產(chǎn)。使用灌流培養(yǎng)模式的不同系統(tǒng)已有文獻報導。詳細介紹，請參考原文。

使用懸浮細胞的病毒載體灌流生產(chǎn)

慢病毒載體

慢病毒的半衰期為4-16小時，所以對于其生產(chǎn)來說，批次或補料分批不是非常有吸引力的選擇?！凹佟惫嗔骺捎糜诼《镜男∫?guī)模生產(chǎn)，將轉染時的細胞密度從1x10^6cells/mL提升到5x10^6cells/mL，同時維持2TU/cell的恒定產(chǎn)率。轉染前后，以1RV/day的置換量，離心置換培養(yǎng)基。該方法轉移至生物反應器規(guī)模時，轉染后進行灌流，可收獲慢病毒，去除殘留的轉染復合物，并為轉染的細胞提供額外的營養(yǎng)物質(zhì)。

最近，Manceur等使用可誘導HEK293生產(chǎn)細胞系，生產(chǎn)慢病毒載體。實驗測試了兩個不同的灌流策略。在第一種策略中，在整個生物工藝過程中（誘導前/后）使用基礎商業(yè)培養(yǎng)基進行灌流。在第二種策略中，使用強化的培養(yǎng)基達到目標高細胞密度，并在誘導后開始灌流模式。使用灌流策略，病毒滴度達到8x10^10TU/L，是批次模式的15倍。

逆轉錄病毒載體

灌流也被用于逆轉錄病毒的生產(chǎn)，使用懸浮馴化的293GPG包裝細胞。使用3L生物反應器灌流培養(yǎng)，結果顯示，相比批次模式，莫洛尼小鼠白血病病毒（MoMLV）病毒顆粒滴度增加2倍（2.3x10^7IVP/mL）。Grieger等測試了從懸浮培養(yǎng)基中連續(xù)收獲rAAV的方法，相比批次對照組，AAV8和AAV9分別增加了6.5倍和4.8倍。

腺病毒載體

腺病毒載體生產(chǎn)時，如以批次模式進行，在高細胞濃度條件下，會觀察到細胞密度效應。已經(jīng)研究過不同的方法，以規(guī)避這個問題，例如在轉染前后置換培養(yǎng)基以及通過補料分批優(yōu)化批次結果。但灌流是克服腺病毒生產(chǎn)中細胞密度效應的最可行的策略。在用于重組腺病毒的293S細胞培養(yǎng)中，為提高細胞密度，使用TFF設備，以灌流模式進行了腺病毒的生產(chǎn)。在1VVD的灌流速率條件下，10天內(nèi)，293S細胞生長至14x10^6cells/mL。用于腺病毒生產(chǎn)時，三個293細胞培養(yǎng)以1VVD的灌流速率，平行進行，在平均密度8x10^6cells/mL時感染，即相當于對數(shù)生長中期。一個培養(yǎng)設置為37℃，另兩個設置為35℃。結果是，在37℃條件下，可生產(chǎn)3.2x10^9感染性病毒顆粒（IVP）/mL，在35℃條件下為7.8x10^9IVP/mL，至少是批次對照組的5.5倍。

ATF灌流設備也被測試用于溶瘤性腺病毒載體（ONYX-411）的生產(chǎn)，使用HeLaS3細胞系。生物反應器以批次模式開始，當乳酸濃度超過1.3g/L時，開始灌流。補液策略基于維持葡萄糖濃度高于2g/L，且乳酸濃度低于2g/L。每天兩次檢查灌流速率，以滿足細胞培養(yǎng)要求。培養(yǎng)感染后，停止灌流3小時，以避免“洗掉”用于感染的病毒。結果顯示，補料分批和灌流培養(yǎng)的平均細胞特異性病毒產(chǎn)率相當，分別為3.1x10^4VP/cell和3.3x10^4VP/cell。但是收獲時，灌流培養(yǎng)中檢測到的平均病毒滴度約為補料分批培養(yǎng)的4倍，因為在感染時，活細胞密度差為4倍。

總結和展望

隨著新一代基因治療臨床試驗數(shù)量的增加，以及新的、基于細胞的疫苗的不斷發(fā)展，在未來的一段時間內(nèi)，病毒顆粒生產(chǎn)技術還將繼續(xù)其革新，以作為向患者有效、安全地提供新型治療方法的關鍵部分。為滿足這方面的預期，必需面對一些挑戰(zhàn)。首先，需要降低生產(chǎn)的成本，以使工藝更具經(jīng)濟性，更有行業(yè)競爭力，以獲得患者“負擔得起”的治療方式。其次，需要建立更加靈活的生產(chǎn)設施，以滿足更加多樣化的管線的要求。一方面，建立針對可能的、新病毒的爆發(fā)的快速反應，生產(chǎn)所需的疫苗，是必然的要求。而另一方面，藥物也在向更加個體化的方向發(fā)展，待治療的患者群體更小，治療更加“精準”。這也就意味著未來的生產(chǎn)設施需具有生產(chǎn)多個藥物的能力，而每個的生產(chǎn)量則可能會降低。新技術的發(fā)展需能相應這些挑戰(zhàn)。

生物制藥行業(yè)的生產(chǎn)模式的轉變正在發(fā)生，批次和補料分批模式正逐漸被連續(xù)生產(chǎn)取代。使用連續(xù)技術獲得的病毒顆粒生產(chǎn)的成功案例、新的監(jiān)測和控制技術的發(fā)展以及連續(xù)下游工藝的整合，將極大的促進連續(xù)平臺的鞏固，以用于作為治療性藥物的病毒的生產(chǎn)和純化。

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本文節(jié)選自以下文章，因水平有限，如有不當之處，敬請諒解。詳細的完整內(nèi)容，請參考原文。

參考原文：

S.Gutierrez-Granados, F.Godia, L.Cervera, Continuous manufacturing of viral particles. Current Opinion In Chemical Engineering. 2018, 22: 107-114.