2019年2月，華盈生物合作伙伴上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所陳賽娟院士課題組在美國科學(xué)院院報（PNAS）上（PMID:30659143）在線發(fā)表了高三尖杉酯堿治療白血病的新機制。

（HHT通過直接結(jié)合NF-κB抑制因子下調(diào)MYC轉(zhuǎn)錄表達(dá)）

本文涉及蛋白質(zhì)譜技術(shù)和關(guān)鍵生物信息分析

由華盈生物提供

急性粒細(xì)胞白血?。ˋML）是一組造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病，其特點是骨髓細(xì)胞分化受阻，成纖維細(xì)胞聚集。中藥高三尖杉酯堿（HHT）是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑，具有抗髓性白血病的作用，尤其針對t(8;21)亞型具有良好的預(yù)后效果。HHT對AML t(8;21)亞型的選擇性作用反映出其更多的抗白血病作用機制，那么，問題來了，HHT的作用機制是啥呢，該如何研究？別急，且聽小編為您一一道來。

本文作者通過HHT處理的t(8;21)小鼠白血病模型發(fā)現(xiàn)白血病發(fā)生的驅(qū)動因素MYC基因產(chǎn)生下調(diào)，并利用pull down實驗+蛋白質(zhì)譜技術(shù)找到HHT的直接結(jié)合蛋白NKRF，發(fā)現(xiàn)其與MYC的間接調(diào)控作用，從而揭開系列作用機制。

華盈視角為您傾情解讀 ???

1. HHT治療導(dǎo)致MYC基因表達(dá)下調(diào)

研究人員在RUNX1-RUNX1T1和KIT^N822Kmut共表達(dá)t(8;21)小鼠白血病模型中，發(fā)現(xiàn)HHT對中白血病起始細(xì)胞（Lin^?/Sca-1^?/c-kit⁺；LICs）的活性有顯著的抑制作用，驗證了HHT的治療效果。

隨后，在HHT處理的Kasumi-1細(xì)胞中，通過與未經(jīng)HHT處理細(xì)胞的基因表達(dá)譜比較分析，MYC的表達(dá)在HHT處理的樣品中明顯降低（圖1A）。采用不同的HHT濃度研究了其對經(jīng)典的靶向基因（包括MYC、CTNNB1和MCL1）蛋白水平和mRNA表達(dá)水平的影響，發(fā)現(xiàn)HHT引起MYC蛋白水平下調(diào)所需的濃度遠(yuǎn)低于CTNNB1和MCL1；MCL1和CTNNB1經(jīng)過HHT作用后其mRNA表達(dá)水平不下降，而MYC的mRNA表達(dá)水平明顯下降（圖1B）。該結(jié)果說明HHT對MYC的下調(diào)是蛋白水平與轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平不同機制的共同作用，而HHT對MYC的轉(zhuǎn)錄下調(diào)機制就是本文的新發(fā)現(xiàn)。

接下來，研究人員評估了6個AML細(xì)胞系Kasumi-1, SKNO-1, NB4, HL-60, U937和 THP-1中MYC的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MYC的轉(zhuǎn)錄水平與這6個細(xì)胞系對HHT的敏感性相關(guān)（圖1C）。

綜合結(jié)果表明，HHT可以減弱t(8;21) AML細(xì)胞中MYC基因的表達(dá)，并且下調(diào)作用可能與HHT的治療效果相關(guān)。

圖1 HHT治療導(dǎo)致MYC基因表達(dá)下調(diào)

2. HHT靶向MYC轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NKRF

HHT是如何調(diào)節(jié)MYC的，是直接作用還是間接作用呢？研究人員用生物素標(biāo)記的HHT（bio-HHT）孵育Kasumi-1細(xì)胞裂解物，然后采用華盈生物Pull-down+蛋白質(zhì)譜技術(shù)檢測與HHT作用的靶標(biāo)蛋白。根據(jù)質(zhì)譜檢測結(jié)果，華盈生物同時提供關(guān)鍵生物信息分析，最終作者分析得到在bio-HHT組中檢測到9種蛋白與MYC表達(dá)相關(guān)的差異蛋白。其中，6種位于MYC通路的下游（ABCD1, ABCD3, CLIC4, GLYR1, ASNS和ABCF3），3種位于MYC表達(dá)的上游（SRC, STAT1和NKRF）（圖2A）。根據(jù)已知研究，SRC和STAT1能夠上調(diào)MYC的mRNA水平，而NKRF（NF-κB抑制因子）是一種通過抑制p65下調(diào)MYC表達(dá)的抑制劑。

通過Streptavidin（SA）瓊脂糖親和試驗WB結(jié)果表明，只有NKRF能直接與Kasumi-1細(xì)胞中的HHT相互作用（圖2B）。研究人員還發(fā)現(xiàn)NKRF通過第二個雙鏈RNA結(jié)合基序（DSRM2結(jié)構(gòu)域）直接與HHT結(jié)合。而一系列的缺失和突變實驗將HHT直接結(jié)合位點定位到DSRM2結(jié)構(gòu)域的K479和C480氨基酸（圖2C）。

圖2 HHT靶向MYC轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NKRF

3. HHT通過結(jié)合NKRF和激活p65信號下調(diào)MYC表達(dá)

據(jù)報道，NKRF維持NF-κB處于非活性狀態(tài)，并抑制其下游MYC表達(dá)的激活。本文研究使用TNF-α來分析p65信號激活的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在TNF-α刺激的Kasumi-1 細(xì)胞中，HHT處理通過占據(jù)DSRM2結(jié)構(gòu)域?qū)KRF從核（包括核仁）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，促進(jìn)p65-NKRF的相互作用，同時干擾p65-p50復(fù)合物的形成（圖3A），從而減弱p65對MYC基因的激活，而不涉及p65的經(jīng)典翻譯后修飾（圖3B）。分別用靶向NKRF的shRNA(shNKRF)和雜亂shRNA(shSCR)轉(zhuǎn)染Kasumi-1和SKNO-1細(xì)胞，建立小鼠移植模型。在內(nèi)源性NKRF被shRNA敲除50%后發(fā)現(xiàn)，敲除降低了HHT誘導(dǎo)的p65易位（圖3C），Kasumi-1細(xì)胞中HHT在下調(diào)MYC的過程中也明顯失去了作用（圖3D）。

圖3 HHT處理后p65蛋白的激活情況

4. HHT對KIT表達(dá)的抑制與MYC下調(diào)相關(guān)

據(jù)先前的研究報告，81.3%的t(8;21) AML患者可檢測到KIT的過度表達(dá)。在這里，研究人員觀察到37個原發(fā)性AML樣本中MYC和KIT表達(dá)之間的顯著相關(guān)性（圖4A），特別是在t(8;21) AML患者中（圖4B）。在用HHT處理24小時的Kasumi-1和SKNO-1細(xì)胞中，KIT的mRNA和蛋白質(zhì)水平與MYC一起下調(diào)（圖4C）。通過觀察發(fā)現(xiàn)，KIT和MYC表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)一步增強。

圖4 KIT和MYC表達(dá)相關(guān)性

研究路線：

HHT是一種經(jīng)典的中藥小分子，已應(yīng)用于白血病治療30多年，以往對于HHT機制的認(rèn)識一般為HHT通過抑制核糖體延伸過程中的mRNA翻譯起到治療AML的作用。本文利用小分子pull down實驗結(jié)合蛋白質(zhì)譜技術(shù)篩選到HTT的直接結(jié)合NKRF蛋白（NF-κB抑制因子），并以NKRF蛋白為線索，通過深入的生信分析和文獻(xiàn)挖掘，找到了一條全新的HHT作用機制。即HHT通過直接結(jié)合NF-κB抑制因子NKRF下調(diào)MYC轉(zhuǎn)錄表達(dá)，通過下調(diào)MYC轉(zhuǎn)錄表達(dá)抑制KIT的表達(dá)從而達(dá)到t(8;21) AML良好的治療效果。 

本文研究邏輯緊密，技術(shù)路線十分經(jīng)典，為致力于尋找藥物靶標(biāo)、探索其作用機制的研究人員提供了優(yōu)秀的研究范本，值得推薦。

英文文獻(xiàn)鏈接：

www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1818539116

蛋白質(zhì)譜服務(wù)簡介

華盈生物提供的蛋白質(zhì)譜業(yè)務(wù)類型有：pull down+LC-MS/MS、Co-IP+ LC-MS/MS、膠條鑒定、Label free、iTRAQ/TMT等?？蓱?yīng)用于藥物靶點、疾病標(biāo)志物、發(fā)病機理、特殊功能蛋白質(zhì)篩選、植物品種改良、工程菌改造等生物醫(yī)藥領(lǐng)域的大部分蛋白研究科研需求。