CRISPR-Cas9系統(tǒng)是目前最流行的基因組編輯技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除、插入和突變，該技術(shù)是一種由RNA指導(dǎo)Cas蛋白對靶基因定性修飾技術(shù)?？茖W(xué)家為了讓Cas蛋白定向剪切DNA序列，在CRISPR工作機(jī)理的基礎(chǔ)上，人為重組了一段目的基因的sgRNA（small-guide RNA），在sgRNA的引導(dǎo)下，Cas9蛋白可以實(shí)現(xiàn)對目的基因的定向切割。本文主要介紹，目的基因sgRNA設(shè)計(jì)和如何將sgRNA構(gòu)建到CRISPR-Cas相關(guān)載體。

目前設(shè)計(jì)sgRNA的網(wǎng)站比較多，張鋒老師實(shí)驗(yàn)組總結(jié)了sgRNA設(shè)計(jì)工具如：https://zlab.bio/guide-design-resources，其中synthego（https://www./products/bioinformatics/crispr-design-tool）是小編比較喜歡用的設(shè)計(jì)工具。不過該網(wǎng)站只能設(shè)計(jì)人、果蠅和小鼠基因的sgRNA。以人的基因TP53為例，介紹TP53基因sgRNA的設(shè)計(jì)過程。

1.1 打開synthego網(wǎng)站sgRNA設(shè)計(jì)工具，點(diǎn)擊Launch Design Tool

1.2 選擇種屬人Homo sapiens，人的TP53基因的ID號為7157，選擇TP53基因，點(diǎn)擊search；

1.3 搜索結(jié)果分兩部分：推薦的sgRNA和所有的sgRNA。往下滾動滾輪，會看到四條推薦的sgRNA的序列。

1.4 點(diǎn)擊其中一條sgRNA序列，會看到sgRNA在TP53基因上的具體作用位置；

以lentiCRISPRv2載體為例，說明sgRNA是如果構(gòu)建到該載體中。首先，將設(shè)計(jì)好的sgRNA中的U堿基改成T堿基，如TP53基因的sgRNA序列為5’-CAUUGCUUGGGACGGCAAGG-3’，修改后的堿基為5’-CATTGCTTGGGACGGCAAGG-3’，該序列的反向互補(bǔ)序列為3’-GTAACGAACCCTGCCGTTCC-5’。正向序列和反向互補(bǔ)序列退火成雙鏈后就可以連接到載體中，但是需要在序列兩端添加BsmBI酶切后的同源序列，如下圖所示：

在生工生物合成這兩條互補(bǔ)的序列后，退火成雙鏈就可以連接到用BsmBI酶切后的LentiCRISPRv2載體中。sgRNA載體構(gòu)建具體的操作過程如下。

2.1 LentiCRISPR載體酶切和去磷酸化，用BsmBI在37℃酶切30min；

2.2 瓊脂糖凝膠純化酶切的LentiCRISPRv2載體

LentiCRISPR載體的大小為14,873bp，酶切后產(chǎn)生兩個(gè)片段，一條大的為目的片段，小片段大小為1885bp。在LentiCRISPRv2載體中有兩個(gè)BsmBI酶切位點(diǎn)，兩個(gè)位點(diǎn)之間的片段為1885bp，酶切連接后sgRNA正好在U6啟動子下游，連接后的sgRNA下游就是gRNA scaffold序列，與sgRNA一起轉(zhuǎn)錄出來發(fā)揮gRNA的引導(dǎo)功能。

2.3 磷酸化和Oligo退火成雙鏈DNA；

反應(yīng)條件如下：37℃  30min → 95℃  5min，然后按照5℃/min降溫到25℃。

生工生物可以提供磷酸化修飾的引物，可以選擇在Oligo的5’磷酸化修飾，就不需要用T4 PNK磷酸化Oligo鏈了。

2.4 稀釋退火的Oligo鏈；

上一步退火后的雙鏈DNA，按照1:200用水稀釋。

2.5 雙鏈Oligo與酶切的載體連接（室溫連接10min）

2.6 轉(zhuǎn)化到Stbl3細(xì)菌；進(jìn)行后續(xù)篩選。