1. ChIRP-Seq（Chromatin Isolation by RNA Purification）

ChIRP-Seq：培養(yǎng)的細胞在活細胞中交聯(lián)，它們的染色質被提取并均勻化。利用磁性鏈霉親和素珠，將感興趣的RNA與目標RNA雜交并分離得到生物素化互補寡核苷酸。將純化的染色質洗脫成蛋白質、RNA或DNA，然后進行下游檢測以進行鑒定和定量，ChIRP-Seq能在全基因組水平上對lncRNA與染色質之間所有潛在的相互作用位點進行標記。

原理：戊二醛固定細胞后，利用聲波降解法進行細胞裂解和染色質斷裂，在裂解物中加入帶生物素標記的oligo探針與lncRNA雜交，利用鏈霉素親和磁珠分離純化（與生物素親和）。最后加RNaseA，從復合物中將lncRNA結合的蛋白和DNA片段洗脫下來，用于后續(xù)分析。

實驗操作視頻鏈接：https://www./video/3912/chromatin-isolation-by-rna-purification-chirp

實驗操作protocol：

二、RNA原位雜交（RNA in situ hybridization）

RNA原位雜交（RNA in situ hybridization）：在細胞或組織結構保持不變的條件下，用標記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對原則，與待測細胞或組織中相應的基因片段相雜交，經(jīng)顯色反應后在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細胞內(nèi)相應的mRNA/lncRNA等分子，可檢測該lncRNA是否位于核內(nèi)或在細胞內(nèi)的分布情況。

原理：將特定標記的已知序列核酸做為探針與細胞或組織切片中的核酸進行雜交，從而對特定核酸進行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細胞標本或組織標本上進行。根據(jù)RNA序列設計cDNA探針，可結合RNA和DNA。

三、熒光原位雜交 (fluorescence in situ hybridization, FISH)

FISH：對于RNA分布定位，一般會使用熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）。該技術利用熒光探針，根據(jù)堿基互補的原則, 在細胞或組織內(nèi)與靶l(wèi)ncRNA雜交，再利用激光共聚焦顯微鏡等檢測手段，通過熒光分布及強度判斷l(xiāng)ncRNA分子分布狀態(tài)。驗證其亞細胞定位，從而推測lncRNA的調控機制。

原理：用已知的標記單鏈為探針，與材料中未知的單鏈核酸進行特異性結合，形成可被檢測的雙鏈核酸。將核酸探針的某種核苷酸標記上報告分子，如地高辛，生物素。可利用該報告分子與熒光素標記的特異性親和素之間的免疫化學反應，經(jīng)過熒光檢測體系在鏡下對待測DNA或RNA進行定性，定量或相對定位分析。

實驗操作視頻鏈接

https://www./video/3328/in-situ-hybridization-for-precise-localization-transcripts

實驗操作protocol：

四、RACE（rapid amplification of cDNA ends）

RACE：基于PCR技術基礎上由已知的一段cDNA，通過往兩端延伸而獲得完整的3’和5’端的方法。該方法可確定lnc RNA5’和3’末端序列，進而獲得lncRNA的全長序列

3’原理：利用RNA3’端PolyA尾做為引物結合點，利用Oligo(dt)作為引物反轉錄合成第一鏈cDNA，然后以一個基因特意引物GSP1作為上游引物，用一個通用引物UPM做下游引物，以cDNA第一鏈為模板，進行PCR擴增，吧目的基因3’端的DNA片段擴增出來。

5’原理：利用Oligo（dt）結合3’端PolyA反轉出第一鏈cDNA，利用反轉錄酶的末端轉移酶的活性在第一鏈的5’端加上3-5個（dc）殘基，退火后與Oligo（dg）通用引物，一第一鏈為模板延伸并接上通用接頭。然后用通用引物UPM為上游，特意基因引物GSP2為下游以第一鏈為模板進行PCR擴增，把目的基因5’端cDNA片段擴增出來。

Self-ligation原理：用5’端磷酸化RT Primer反轉錄，用RNA酶將RNA分解，用RNA ligase進行環(huán)化或形成首尾連接物，PCR擴增5’端未知區(qū)域，膠回收后DNA序列測定。

五、Northern blot

Northern blot：將待檢測的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記物標記的DNA或RNA探針進行反應。通過檢測RNA的表達水平來檢測基因表達。

原理：根據(jù)分子量大小不同將不同的RNA分離開來，將其原位轉移至固相支持物上，再用標記過的DNA或RNA為探針，依據(jù)堿基互補配對原則進行雜交，最后進行顯影或顯色。以目標RNA所在位置，顯影強度可指示目標RNA在所測樣品中的相對含量。

六、熒光素酶報告基因實驗（檢測miRNA對mRNA表達）

熒光素酶報告系統(tǒng)：在熒光素酶報告基因載體的報告基因編碼區(qū)下游插入lncRNA結合序列或者mRNA 3’UTR區(qū)，然后將載體轉染細胞并改變細胞中miRNA的表達水平，通過檢測熒光素酶的表達情況以分析lnc RNA或mRNA的3’UTR區(qū)中是否含有miRNA的靶點。

實驗操作視頻鏈接

https://www./video/3343/identifying-targets-human-micrornas-with-lightswitch-luciferase-assay

實驗操作protocol：

七、CLIP-Seq(crosslinking-immunprecipitation and high-throughput sequencing）

CLIP-Seq：也稱為HITS-CLIP，是將紫外交聯(lián)免疫共沉淀技術與高通量測序技術相結合，在全基因組水平上揭示RNA分子與RNA結合蛋白相互作用的技術。

原理：在紫外照射下將細胞內(nèi)RNA分子與RNA結合蛋白進行偶聯(lián)，細胞裂解，通過免疫沉淀將RNA與蛋白質復合體沉淀，核酸酶將共沉淀RNA切割，只保留蛋白質內(nèi)部的RNA片段。通過5’端放射性標記分子及SDS-PAGE電泳，選擇性回收蛋白結合的RNA片段，最后進行高通量測序。

實驗操作視頻鏈接

https://www./video/2638/iclip-transcriptome-wide-mapping-protein-rna-interactions-with

實驗操作protocol：

八、RIP(RNA Immunoprecipitation)

RNA蛋白免疫沉促使細胞內(nèi)RNA，蛋白質之間交聯(lián)，形成RNA-Protein復合物。之后用特異性抗體免疫沉淀復合物，與蛋白質結合的RNA即可被分離，純化。之后對分離的RNA進行PT-PCR，RIP-Chip或高通量測序（RIP-Seq）分析。

九、EMSA(electrophoretic mobility shift assay)

凝膠遷移或電泳遷移實驗，是一種研究DNA-蛋白質或RNA-蛋白質相互作用的技術。

原理：將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物和非結合的探針。RNA復合物比非結合的探針移動的慢。該實驗是將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物和非結合的探針。如果蛋白質可以跟DNA或RNA結合，它的泳動速度就會比非結合的DNA或RNA探針慢。

實驗操作視頻鏈接

https://www./video/54093/screening-for-functional-non-coding-genetic-variants-using

十、RNA Pulldown

使用體外轉錄法標記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質復合物，該復合物可與鏈霉親和素標記的磁珠結合，從而與孵育液中的其他成分分離。復合物洗脫后，通過WB或MS來檢測。

實驗操作視頻鏈接：https://www./video/57786/biotin-based-pulldown-assay-to-validate-mrna-targets-cellular