熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization, FISH）通過(guò)熒光標(biāo)記的核酸探針（~20nt-500nt）在組織細(xì)胞內(nèi)原位標(biāo)記相應(yīng)的RNA分子。一種熒光基團(tuán)標(biāo)記的一個(gè)探針對(duì)應(yīng)一個(gè)基因RNA分子的一段序列。超分辨率顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，使我們能看見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)單個(gè)RNA分子。單分子熒光原位雜交（single molecule FISH，smFISH）能分析單個(gè)基因的RNA分子拷貝數(shù)和原位分布情況。受熒光基團(tuán)和圖像采集通道的限制，smFISH只能同時(shí)看到4到5個(gè)基因的RNA分子分布情況?？茖W(xué)家希望能同時(shí)分析多個(gè)基因乃至整個(gè)轉(zhuǎn)錄組水平RNA分子的時(shí)空分布情況，其中關(guān)鍵是結(jié)合超分辨率顯微鏡技術(shù)開(kāi)發(fā)多路組合標(biāo)記和多重讀取系統(tǒng)（multiplexing）以實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多個(gè)基因的識(shí)別。

2019年3月26日，Nature在線發(fā)表了加州理工蔡龍（謝曉亮教授在哈佛培養(yǎng)的博士）實(shí)驗(yàn)室的最新研究成果：Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH+。本文中，通過(guò)seqFISH技術(shù)進(jìn)行四輪的RNA分子條形碼標(biāo)記（barcoding）實(shí)驗(yàn)，每輪實(shí)驗(yàn)中通過(guò)其獨(dú)特60個(gè)假單色（pseudocolor）通道進(jìn)行20次反復(fù)雜交和超分辨成像讀取。這樣，在普通共聚焦顯微鏡上實(shí)現(xiàn)了對(duì)10,000基因的mRNA分子在組織原位的觀測(cè)和分析。

seqFISH技術(shù)通過(guò)多輪的熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)和成像對(duì)單個(gè)RNA分子進(jìn)行了條形碼式標(biāo)記和識(shí)別（圖1）【1】。本文中每個(gè)基因設(shè)計(jì)有24個(gè)探針以識(shí)別，每個(gè)探針?lè)肿由嫌兴亩?/span>（I-IV）延展序列，以對(duì)應(yīng)四輪的seqFISH標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。每個(gè)延展序列能通過(guò)與對(duì)應(yīng)的讀出探針（readout）雜交成像被讀取。每輪對(duì)RNA分子進(jìn)行條形碼標(biāo)記后，加入當(dāng)輪的讀出探針進(jìn)行20次的反復(fù)雜交和成像讀取（圖1）。在三個(gè)熒光通道成像的情況下實(shí)現(xiàn)了在組織原位的對(duì)10,000基因的RNA分子的檢測(cè)。

圖1 seqFISH+技術(shù)：seqFISH的條形碼標(biāo)記和多重雜交成像讀取。

本文中，對(duì)成像的細(xì)胞和神經(jīng)組織進(jìn)行了透明化處理【2】。本文能觀察到不同RNA分子有相應(yīng)的亞細(xì)胞定位，RNA分子呈現(xiàn)三個(gè)位置的聚集：核和近核區(qū)；胞質(zhì)區(qū)以及突出區(qū)，反映了它們?cè)诠δ苌系牟煌?/strong>

圖2 RNA分子亞細(xì)胞定位富集

本文還對(duì)小鼠腦部皮層，室管膜下層和嗅球區(qū)域進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組水平分析，一共收集了2,963個(gè)細(xì)胞中RNA分子的分布。其中在皮層區(qū)域，檢測(cè)讀取到平均約 5,615 ± 3,307 (mean ± s.d.) RNA分子，分屬于 3,338 ± 1,489 (mean ± s.d.) 基因。通過(guò)非監(jiān)督聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)不同神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)分層排布，和以前的單細(xì)胞RNAseq成果相符合（圖3）。

圖3 不同皮層細(xì)胞呈現(xiàn)RNA分子組成的差異。

通過(guò)標(biāo)記和讀取設(shè)計(jì)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)創(chuàng)新，本文在普通共聚焦顯微鏡下實(shí)現(xiàn)了對(duì)多基因（10,000）RNA分子在組織原位的定位和檢測(cè)分析。單分子熒光超分辨率成像，組織透明化并膨大技術(shù)，RNA條形碼標(biāo)記，多重標(biāo)記成像等多種技術(shù)并用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)神經(jīng)組織進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平的分析。

原文鏈接：

https://www./articles/s41586-019-1049-y

制版人：半夏

1. Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M. & Cai, L. Single-cell in situRNA profiling by sequential hybridization. Nat. Methods 11, 360–361 (2014).

2. Yang, B. et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue throughwhole-body clearing. Cell 158, 945–958 (2014).