免疫系統(tǒng)在腫瘤監(jiān)測和清除的進程中起著非常重要的作用，腫瘤細胞在多種機制的幫助下做出免疫逃逸被認為是癌癥進展的標志之一。作為免疫療法的重要代表，免疫檢查點抑制劑（Immune checkpoint inhibitor，ICI）對一些轉(zhuǎn)移性癌癥患者非常有益，但通常需要預測性生物標志物來診斷患者。自腫瘤突變負荷（TMB）與免疫治療獲益之間的密切關(guān)系被揭示以來，圍繞TMB的研究也越來越豐富。去年10月，美國NCCN（綜合癌癥網(wǎng)絡）將TMB正式列入非小細胞肺癌（NSCLC）指南，最近一期的Nature Genetics雜志發(fā)表了一篇關(guān)于TMB的研究文章，為TMB作為免疫療法標志物落下了“實錘”。

腫瘤微環(huán)境中的免疫應答過程（圖片源自參考文章3）

以TMB作為標志物臨床早已有應用，在CTLA-4抑制劑治療黑色素瘤，PD-1/PD-L1抑制劑治療黑色素瘤、膀胱癌和NSCLC中均有觀察到高突變負荷TMB和臨床效益之間的關(guān)聯(lián)性。但既往研究ICI治療后TMB與生存率關(guān)系的臨床樣本量較小，目前對TMB是否具有各種癌癥臨床獲益的預測性尚無十足把握，也不清楚這種獲益一旦超出臨床特定試驗人群后是否還有效。為了獲得更廣泛地數(shù)據(jù)，這項最新研究共囊括1662名接受ICI治療晚期癌癥和5371名未接受ICI治療患者的臨床和基因組數(shù)據(jù)，并對這些患者的腫瘤采用了新一代靶向測序技術(shù)MSK-IMPACT。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有患者中，高TMB（不同腫瘤組織均值約20%）與較好的總生存期（OS）呈正相關(guān)，證明在大多數(shù)癌癥中，TMB升高與生存率提高之間存在相關(guān)性。

不同癌癥TMB的閾值與死亡危害比之間的關(guān)系（圖片源自參考文章2）

此外，該研究還對每個癌癥類型進行了區(qū)別性分析，將每個組織學中突變負荷最高的前20%作為該癌癥類型的TMB高組。這樣操作的原因是TMB在不同組織學中分布不同，每種癌癥類型TMB前20%的閾值存在顯著差異，也就是說不可能有一個通用的閾值定義“何謂高TMB”，來預測ICI在所有癌癥類型中的臨床效益。這種不同腫瘤組織學的TMB差異以及對ICI應答閾值的差異很可能是由于腫瘤微環(huán)境造成的，包括單克隆免疫滲透、免疫細胞排斥、人類白細胞抗原基因型變化和檢查點分子的表達水平等因素。

TMB程度在不同癌癥類型中的分布情況（圖片源自參考文章2）

這種分層研究更有利于觀察不同癌癥類型的OS與TMB的關(guān)聯(lián)，雖然可能由于樣本量的原因，對個別癌癥（如膠質(zhì)瘤）的影響沒有達到統(tǒng)計學意義，但幾乎所有類型的癌癥都觀察到了高TMB與整體生存率較高的大趨勢，這些都說明TMB與ICI術(shù)后生存率提高之間的關(guān)系可能存在于大多數(shù)癌癥類型中。TMB在許多癌癥組織學上作為一個連續(xù)變量，在較長的OS中都能觀察到類似的標志物關(guān)聯(lián)性趨勢。與OS的改善一致，在如NSCLC、黑色素瘤、食管胃癌、頭頸癌和腎細胞癌等類型中，TMB與ICI的客觀緩解率（ORR）或PFS之間也存在類似的相關(guān)性。

TMB程度與總生存期之間的關(guān)聯(lián)性（圖片源自參考文章2）

研究人員還對5371名轉(zhuǎn)移性癌癥并且沒有接受過ICI治療的患者腫瘤做了MSK-IMPACT測序，在這些患者中，TMB的升高與OS的提高沒有關(guān)聯(lián)性。這就排除了這種TMB與患者生存率的正關(guān)聯(lián)僅僅是由預后患者間的TMB差異導致的，而與ICI治療無關(guān)這樣一種可能。

這項研究成果解決了腫瘤免疫學中幾個重要的基本問題：一是驗證了突變負荷可以用來預測接受抗CTLA-4或抗PD-1治療患者的生存率。二是這項研究采用了迄今為止使用ICI治療的最大規(guī)?；颊呋蚪M數(shù)據(jù)，可以對TMB的臨床療效影響進行量化分析，證明較高TMB與較高OS之間的持續(xù)相關(guān)性。最后，研究發(fā)現(xiàn)對“高”TMB的定義要因癌癥不同類型而異，很難用一個通用閾值來預測所有癌癥患者從ICI獲益的可能?？傊?，這一發(fā)現(xiàn)再次強調(diào)了TMB作為預測性生物標志物的可靠性，具有重要的臨床價值。

TMB作為標志物對ICI治療NSCLC的臨床獲益預測（圖片源自參考文章2）

鑒于免疫治療的潛在毒性和對ICI的高度可變反應，以及這類療法的巨大經(jīng)濟成本，迫切需要能夠用來預測指導ICI用藥的陽性或陰性預測生物標志物。陽性預測可以正確判斷哪些患者能夠產(chǎn)生治療響應；而陰性預測用來確定哪些患者從當前療法中無法獲益。利用生物標志物可以對患者進行單藥或聯(lián)合用藥的分組，或是決定將免疫療法用于不同患者群的一線和挽救治療，或是采用替代療法以避免不必要的毒性。除TMB外，目前已驗證具有免疫療法生物標志物作用的有PD-L1表達、淋巴細胞浸潤水平、T細胞受體克隆性、外周血標志物、免疫相關(guān)基因表達以及多路復用免疫組化等，下面簡要介紹一下。

在Nivolumab用于黑素瘤、NSCLC、腎細胞癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌的I期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，通過檢測腫瘤細胞的PD-L1表達可以作為抗PD-1、PD-L1治療的生物標志物。將5%設定為腫瘤細胞PD-L1陽性閾值，在25例PD-L1陽性患者中有9例（36%）對Nivolumab出現(xiàn)ORR，陰性患者中沒有表現(xiàn)出ORR，在晚期黑色素瘤和NSCLC患者中陽性組比陰性組的PFS和OS也都有顯著提高，F(xiàn)DA已批準將PD-L1伴隨診斷用于晚期NSCLC和膀胱癌的治療。但是受PD-L1表達多機制調(diào)控和腫瘤微環(huán)境影響，PD-L1的表達具有取樣時間差異、患者個體差異、甚至瘤內(nèi)異質(zhì)性，其陰性預測作用要低很多。

盡管存在這些局限性，PD-L1表達在免疫療法確定受益患者群仍發(fā)揮著重要作用，特別是在相關(guān)臨床試驗中，確保PD-L1陽性腫瘤患者在比較群組中的平均分布是非常必要的，可以避免由生物學差異而引入的實驗偏差。

許多癌癥的回顧性研究都發(fā)現(xiàn)，淋巴細胞的浸潤程度與患者生存率有關(guān)聯(lián)，在實體腫瘤聚集處，如結(jié)直腸癌和黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)異位淋巴結(jié)狀結(jié)構(gòu)能夠更好地預測患者生存。例如，與CD8 腫瘤浸潤淋巴細胞程度較低的放化療III期NSCLC患者相比，腫瘤浸潤程度高的患者群PFS和OS都更長。這種淋巴細胞浸潤程度的背后機理被認為是能夠激起自身免疫應答或T細胞炎癥腫瘤表型，通過免疫機制改善疾病控制，因此可以作為預后生物標志物。

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤淋巴細胞浸潤的T細胞受體靶向腫瘤特異性免疫反應，與Pembrolizumab的臨床應答相關(guān)，結(jié)果表明基線T細胞受體克隆性與腫瘤浸潤淋巴細胞密度的相關(guān)性不高。當浸潤淋巴細胞限制了T細胞受體對腫瘤抗原的特異性克隆，即便是腫瘤浸潤淋巴細胞密度較低的患者，仍然可以在抗PD-1治療中獲益。當然這種假設尚需要從大量臨床試驗中得到進一步驗證，并且可能還需要確認可識別的腫瘤抗原，然后才能將該方法應用于生物標志物。

外周血標志物的優(yōu)勢在于非侵入性的樣品采集方式，雖然這類標志物與臨床療效的一些關(guān)聯(lián)性已有研究，但是尚未有這類標志物真正“落地”具備療法預測性。以Ipilimumab為例，相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)以下指標與患者PFS有關(guān)，包括低絕對中性粒細胞計數(shù)(< 7500個細胞/μL)，中性粒細胞淋巴細胞比例低(< 3)，絕對的單核細胞計數(shù)低(< 650細胞/μL)，低頻髓樣抑制細胞(< 5·1%)、高頻FoxP3 調(diào)節(jié)性T細胞(≥1·5%)，高頻率的淋巴細胞(≥10·5%)，以及高嗜酸性粒細胞計數(shù)(≥50個細胞/μL)，在抗PD-1治療研究中也發(fā)現(xiàn)了一些類似的結(jié)果。此外，外周T細胞數(shù)量，尤其是T細胞受體基因序列或?qū)π驴乖姆磻栽u估也可以作為一種預測生物標志物發(fā)揮潛在作用。

通過基因表達對腫瘤微環(huán)境中活躍的先天或適應性免疫反應進行更廣泛的評估，可以有效地預測ICI療法的臨床效益。對晚期黑色素瘤患者使用Ipilimumab的II期臨床回顧性分析證明，基因表達譜圖確實是一種有用的預測生物標志物。研究人員提取了50份治療前腫瘤活檢標本的總RNA進行分析，將患者分為有臨床應答和無應答兩組，對兩組之間存在顯著差異的基因進行通路分析后發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)炎癥反應。22個與免疫相關(guān)的基因表達至少增加了2·5倍，包括細胞毒性T細胞（如CD8A、顆粒酶B、穿孔蛋白I）、Th1細胞因子或趨化因子、MHCII類和其他免疫相關(guān)基因(如NKG7、IDO1)的標志物，均與OS延長相關(guān)。

通過多重免疫組化技術(shù)直接評價腫瘤和免疫細胞表型及其空間關(guān)系，提供了腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)的信息，這些信息可以作為基因表達譜的補充。包括用單個初級抗體對腫瘤切片進行連續(xù)染色，以獲得感興趣的蛋白質(zhì)，并用顯色或免疫熒光法進行檢測，這種多光譜方法在臨床應用中具有很大的潛力。通過建立多光譜免疫組化平臺，分析黑色素瘤載片上的CD3、CD8、FoxP3、CD163和PD-L1，預測哪些患者能夠成功生成腫瘤浸潤淋巴細胞，選擇合適的細胞療法。僅CD8 T細胞的存在不足以預測腫瘤浸潤淋巴細胞的成功生長，但是CD8 T細胞與CD3 FoxP3 調(diào)節(jié)性T細胞比值與腫瘤浸潤淋巴細胞的成功生長密切相關(guān)。PD-L1 的加入使陰性預測值提高了100%，這種方法也可以應用于其他免疫療法。

將兩種或兩種以上標志物策略聯(lián)合使用來捕捉腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)，可以對ICI治療更有效。以PD-L1表達和淋巴細胞浸潤為例，兩者可能在腫瘤細胞呈現(xiàn)相反的情況，PD-L1表達較高時腫瘤浸潤淋巴細胞計數(shù)較低，反之亦然，在這種情況下，抗PD-1或抗PD-L1單一治療的臨床響應可能較低，而僅以PD-L1表達或腫瘤浸潤淋巴細胞密度作為生物標志物，會產(chǎn)生錯誤的預測。同樣，并非所有高突變或新抗原負荷腫瘤都表現(xiàn)出“先天”的免疫性，這被認為是免疫治療方法的先決條件之一。腫瘤微環(huán)境中還存在多種并發(fā)免疫抑制機制，包括CTLA-4、PD-L2、LAG3、IDO1和IL-10，隨著新的聯(lián)合治療策略的出現(xiàn)，這些都可能成為重要的識別靶點。

參考文章：

[1]BMS Withdraws Application for Nivolumab/Ipilimumab in TMB-High NSCLC.

[2]Tumor mutational load predicts survival after immunotherapy across multiple cancer types.

[3]Predictive biomarkers for checkpoint inhibitorbased immunotherapy.

[4]Approaches to treat immune hot, altered and cold trumors with combination immunotherapies.