重組蛋白在科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用越來(lái)越多，不僅局限于普通蛋白，也用于病毒樣顆粒等的制備。目前已經(jīng)形成了多種表達(dá)和純化策略，這些策略旨在繞過(guò)或緩解蛋白質(zhì)溶解性差、對(duì)宿主的毒性、低水平表達(dá)和純化困難等問(wèn)題。

重組蛋白的親和純化通常是將重組蛋白克隆到含有對(duì)固定化樹(shù)脂具有高度特異性的融合蛋白或肽標(biāo)記的表達(dá)載體中。在許多情況下，融合蛋白或肽也會(huì)增加重組蛋白的溶解性，降低對(duì)宿主細(xì)菌細(xì)胞的毒性。但帶有親和標(biāo)簽的重組蛋白也面臨一些問(wèn)題，比如標(biāo)簽有時(shí)會(huì)對(duì)目的蛋白的結(jié)構(gòu)甚至生物活性產(chǎn)生消極影響，這就需要對(duì)標(biāo)簽進(jìn)行去除。

親和表達(dá)及酶切策略^【1】

1. 融合表達(dá)一個(gè)親和標(biāo)簽及用于純化后酶切的酶切位點(diǎn)linker

2. 親和標(biāo)簽既是純化標(biāo)簽同時(shí)也促進(jìn)目的蛋白的可溶性表達(dá)

3. 用于外切酶（ TAGZyme）在純化后從N端切除親和純化標(biāo)簽

4.部分促進(jìn)可溶性表達(dá)的序列不帶有親和標(biāo)簽，例如Trx，因此需要額外加上親和標(biāo)簽

在本文中，我們將總結(jié)使用親和標(biāo)記來(lái)緩解蛋白質(zhì)溶解性宿主毒性、表達(dá)水平及純化問(wèn)題這的各種策略，親和標(biāo)記去除策略，并討論蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)的未來(lái)方向。

主要融合標(biāo)簽的優(yōu)缺點(diǎn)比較

His-tag是目前IMAC最流行的選擇，具有尺寸小、洗脫條件溫和以及表達(dá)載體的廣泛適用性的優(yōu)點(diǎn)。此外，針對(duì)His-tag的抗體也可商業(yè)獲得，可用于識(shí)別表達(dá)蛋白。因此許多結(jié)晶學(xué)和核磁共振蛋白研究也采用His-tag。盡管His-tag具有許多優(yōu)點(diǎn)，但由于細(xì)菌裂解液中通常也含有某些金屬結(jié)合蛋白，這些蛋白也會(huì)結(jié)合到層析柱上。因此His-tag純化的特異性較弱，如果要得到高純度的目的蛋白，還需要增加純化步驟。此外，如果樣品中含有EDTA等物質(zhì)，會(huì)使填料上的金屬離子掉落，極大的影響純化。

中科森輝開(kāi)發(fā)的組氨酸標(biāo)簽純化介質(zhì)

表位標(biāo)記由含有已知抗原表位的多肽序列組成，且有對(duì)其有適當(dāng)親和力的特異性抗體。由于利用雜交瘤技術(shù)可獲得大量、高純度單克隆抗體，因此可將抗體固定到填料基質(zhì)上，并用于表位標(biāo)記重組蛋白的純化。

1.2.1FLAG

FLAG標(biāo)簽的序列（DYKDDDDK）特意設(shè)計(jì)為在靶蛋白表面具有高度親水性，可以減少對(duì)蛋白質(zhì)折疊的不利影響。DDDDK片段允許用腸激酶剪切標(biāo)簽。

1.2.2c-myc

c-myc標(biāo)簽（EQKLSEDEL）已被用于多種用途，如流式細(xì)胞術(shù)、免疫沉淀以及蛋白質(zhì)純化，但純化已經(jīng)很少用c-myc標(biāo)簽

1.2.3HA

流感病毒HA標(biāo)簽包括YPYDVPDYA。和c-myc標(biāo)簽一樣，HA標(biāo)簽主要用于示蹤，檢測(cè)和純化目的蛋白。

抗原表位標(biāo)記通常被用來(lái)代替His-tag標(biāo)記，因?yàn)樗鼈兙哂懈叩奶禺愋院蜋z測(cè)能力。然而由于免疫親和樹(shù)脂比傳統(tǒng)親和樹(shù)脂更高昂的成本，使用抗體特異性表位標(biāo)記進(jìn)行純化更適合于小規(guī)模純化。

這些蛋白標(biāo)簽通常比表位標(biāo)簽大，包含能結(jié)合至固定在親和樹(shù)脂上的特定配體的功能域/序列。

1.3.1鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（CBP）

CBP是來(lái)自骨骼肌肌球蛋白輕鏈激酶的26個(gè)氨基酸序列，在鈣離子存在下能與鈣調(diào)蛋白結(jié)合。從鈣調(diào)素親和柱中洗脫CBP融合蛋白可以在生理?xiàng)l件下進(jìn)行，這使得該標(biāo)簽成為難以純化的蛋白質(zhì)（如膜蛋白）的一個(gè)吸引人的選擇。缺點(diǎn)是其他一些真核蛋白可能與鈣調(diào)蛋白親和樹(shù)脂相互作用。因此，CBP標(biāo)簽應(yīng)該與細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)一起使用。

1.3.2谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）

GST標(biāo)簽是一種在真核生物中發(fā)現(xiàn)的26kDa酶，能結(jié)合到配體谷胱甘肽上。GST標(biāo)簽最初用于pGEX質(zhì)粒，以促進(jìn)難以純化的真核蛋白的純化。在融合到目標(biāo)蛋白的N端時(shí)，GST標(biāo)簽可能能提高目的蛋白的可溶性及表達(dá)程度。GST可能主要通過(guò)在聚集和不適當(dāng)折疊發(fā)生前穩(wěn)定靶蛋白的折疊來(lái)改善蛋白質(zhì)的表達(dá)，而不是通過(guò)提高溶解性來(lái)改善表達(dá)。

中科森輝開(kāi)發(fā)的GST標(biāo)簽純化介質(zhì)

1.3.3鏈霉親和素結(jié)合肽

鏈霉親和素結(jié)合標(biāo)簽僅由少數(shù)氨基酸組成，并能結(jié)合到一種細(xì)菌蛋白質(zhì)鏈霉親和素上。多年來(lái)，Streptavidin標(biāo)簽序列從AWRHPQFGG改為NWSHPQFEK。這種新的strep-II標(biāo)簽允許將標(biāo)簽放置在N-末端，而不像最初只能在目標(biāo)蛋白的C-末端。與His-tag相比，StrepII的樹(shù)脂更貴，但特異性更強(qiáng)，純化純度更高，甚至可以與各種免疫樹(shù)脂相媲美，但相比之下成本顯著更低。因此，StrepII標(biāo)簽可能是配體標(biāo)簽中最適合大規(guī)模純化的。

1.3.4麥芽糖結(jié)合蛋白

MBP標(biāo)簽是一種來(lái)源于大腸桿菌的42kDa的蛋白，由于其溶解性增強(qiáng)作用而被廣泛用作載體蛋白。MBP對(duì)交聯(lián)的淀粉和麥芽糖具有很高的親和力。然而，MBP融合到重組蛋白的C端可能影響融合蛋白對(duì)淀粉/麥芽糖的親和力，因?yàn)槿诤系鞍卓赡軙?huì)和其結(jié)合位點(diǎn)相互作用。因此，通常需要在MBP的N-端放置His-tag，以促進(jìn)融合蛋白的純化。MBP在提高融合蛋白的溶解性方面也非常有效。

1.4.1彈性蛋白樣多肽

ELP由20-330個(gè)五肽Val-Pro-Gly-Xaa-Gly重復(fù)組成，并通過(guò)標(biāo)簽的溫度依賴性促進(jìn)目的蛋白的純化。根據(jù)五肽重復(fù)序列的數(shù)目和序列，ELP融合蛋白在特定溫度下可經(jīng)歷可逆的相變，并從溶液中沉淀出來(lái)。這樣可以去除上清液中的其他蛋白質(zhì)，同時(shí)分離沉淀的ELP融合蛋白。ELP標(biāo)簽的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它不需要特殊的樹(shù)脂或柱，只需離心就可以。然而，由于這一策略利用了融合蛋白的溶解性變化，因此需要考察ELP的類型以及融合的位點(diǎn)，以產(chǎn)生能適當(dāng)折疊和且具有生理活性的重組蛋白。

1.4.2硫氧還蛋白A（Trx）

硫氧還蛋白A是一種12kDa的酶，催化各種還原氧化反應(yīng)。Trx能顯著降低目的蛋白形成包涵體的幾率。野生型Trx本身并不能通過(guò)親和色譜法進(jìn)行融合蛋白的純化。為了解決這一問(wèn)題，突變的硫氧還蛋白被設(shè)計(jì)成具有含有組氨酸標(biāo)簽，或在體內(nèi)易生物素化，然后通過(guò)親和柱捕獲。

1.4.3NusA

NusA是一種55kDa的大腸桿菌蛋白，其在過(guò)度表達(dá)時(shí)具有很高的溶解性，在重組蛋白表達(dá)和純化過(guò)程中能增加其融合蛋白的溶解性。與麥芽糖結(jié)合蛋白相比，盡管NusA具有非常不同的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)，但其溶解性增強(qiáng)效果大致相同。由于NusA與特定的樹(shù)脂沒(méi)有很強(qiáng)的結(jié)合親和力，它被設(shè)計(jì)成具His-tag的表達(dá)載體以方便純化。

以上我們可以總結(jié)出，廣泛使用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域標(biāo)簽具有共同的特性：增加了重組蛋白的溶解性和表達(dá)水平。這兩種增強(qiáng)效應(yīng)是通過(guò)一種目前尚不清楚的機(jī)制產(chǎn)生的，因?yàn)榧词故腔瘜W(xué)上不同的結(jié)構(gòu)，如MBP和NusA，也可能具有類似的蛋白質(zhì)表達(dá)和溶解作用。有假設(shè)認(rèn)為這些載體蛋白可能作為伴侶促進(jìn)來(lái)目的蛋白質(zhì)的折疊。

在通過(guò)親和力分離純化目的蛋白后，如果標(biāo)簽的存在將顯著影響其生物功能或適用該蛋白的安全性，則需要能夠移除這些標(biāo)簽，并且這一操作通常時(shí)有必要的。許多策略被設(shè)計(jì)用來(lái)在純化后去除標(biāo)簽。

常用的標(biāo)簽去除方法及其優(yōu)缺點(diǎn)

這種37kDa的絲氨酸蛋白酶被廣泛使用，通過(guò)切割LVPR*GS的凝血酶識(shí)別序列，從靶蛋白中去除His-tag和其他標(biāo)簽。盡管凝血酶識(shí)別的序列是相對(duì)特異的，但有報(bào)道稱，凝血酶的商業(yè)制備會(huì)導(dǎo)致非特異性酶切。凝血酶比其他蛋白酶的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它能夠在多種表面活性劑存在下保持高活性。因此，凝血酶可用于純化膜蛋白。

TEV蛋白酶是在煙草蝕刻病毒中發(fā)現(xiàn)的一種酶的27kDa的C端催化亞單位。它對(duì)序列ENLYFQ*S.具有高度特異性。最初發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，該蛋白酶會(huì)自我消化。然而，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行各種突變修改，已可以作為去除標(biāo)簽的工具。研究發(fā)現(xiàn)，S219V突變使其蛋白水解酶活性增加了至少兩倍，同時(shí)也降低了自身降解的敏感性。此外，缺乏C端238-242殘基的蛋白酶變體具有更高的表達(dá)量和催化活性。TEV蛋白酶的主要缺點(diǎn)是與其他蛋白酶相比轉(zhuǎn)化率較低。其較低的轉(zhuǎn)化率可能解釋了其對(duì)識(shí)別序列的高度特異性，但導(dǎo)致消化時(shí)間長(zhǎng)和消化所需的蛋白酶量較高。然而一個(gè)優(yōu)勢(shì)是，識(shí)別序列中的絲氨酸可以轉(zhuǎn)變成蛋氨酸，在酶切后能產(chǎn)生一個(gè)“天然”的N末端。由于TEV蛋白酶切位點(diǎn)的廣泛性和低成本，也是大規(guī)模純化中很好的選擇。

3C蛋白酶是一種來(lái)源于人鼻病毒的48kDa大小的重組半胱氨酸蛋白酶。與TEV蛋白酶一樣，它對(duì)其識(shí)別序列LEVLFQ*GP具有高度特異性。3C蛋白酶也被設(shè)計(jì)成含有一個(gè)親和標(biāo)簽，它有助于在裂解后將其從純化蛋白溶液中去除。主要缺點(diǎn)是酶切后不能目的蛋白不能形成天然N末端。另一方面，與TEV蛋白酶相比，3C蛋白酶在4攝氏度下有10倍以上的活性。

內(nèi)蛋白在細(xì)菌和酵母菌中發(fā)現(xiàn)的能夠自我切除的蛋白質(zhì)，并且已經(jīng)被改進(jìn)成為能夠在N末端或C末端進(jìn)行剪切以達(dá)到目的蛋白標(biāo)簽去除的目的。例如來(lái)自結(jié)核分枝桿菌的微小內(nèi)肽蛋白I-CM突變體已被設(shè)計(jì)成有利于C末端剪切。當(dāng)pH值變成6時(shí)，C端到I-CM蛋白的序列將被剪切。如果將一個(gè)親和標(biāo)簽融合在內(nèi)蛋白的N端，目的蛋白在C端，則可在一定條件下實(shí)現(xiàn)無(wú)標(biāo)簽蛋白的純化。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是不需要使用蛋白酶來(lái)切割親和標(biāo)簽。缺點(diǎn)是必須將蛋白分成兩部分進(jìn)行純化，以便于純化后的反式剪切，并且可能留有額外的氨基酸殘基。此外在室溫下完全剪切需要比蛋白酶剪切更長(zhǎng)的時(shí)間。由于用于蛋白質(zhì)純化的內(nèi)蛋白種類繁多，目前還沒(méi)有一個(gè)可以應(yīng)用于各種不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)或通用方案。

用于蛋白質(zhì)純化的最常見(jiàn)的SUMO蛋白酶是Ulp1，一種27kDa的酵母酶，能夠?qū)?strong>SUMO部分從靶蛋白中去除。與其他識(shí)別線性氨基酸序列的蛋白酶不同，SUMO蛋白酶識(shí)別其底物的三級(jí)結(jié)構(gòu)，因此具有高度特異性。SUMO底物是一個(gè)通常在目的蛋白N端加入的用于提高其溶解性和表達(dá)的10kDa的蛋白，與MBP水平相當(dāng)。與其他蛋白酶相比，它的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)是在2M尿素和高鹽濃度的條件下依然具有較高的酶切活性。SUMO純化系統(tǒng)是一個(gè)具有高溶解性、高位點(diǎn)酶切特異性、能產(chǎn)生天然N末端等優(yōu)勢(shì)的可靠的蛋白質(zhì)表達(dá)與純化平臺(tái)。但缺點(diǎn)是成本相對(duì)較高。

回顧過(guò)去幾十年為表達(dá)和純化重組蛋白而開(kāi)發(fā)的親和標(biāo)簽的發(fā)展趨勢(shì)，為了提高純化效率，已經(jīng)向使用IMAC進(jìn)行了重大轉(zhuǎn)移。從2000年起，由于免疫親和樹(shù)脂的持續(xù)高成本以及其他純化系統(tǒng)的改進(jìn)，使用表位標(biāo)簽的研究已經(jīng)大幅減少。但在需要載體蛋白促進(jìn)適當(dāng)折疊、增加溶解性和提高表達(dá)水平的應(yīng)用中，這些標(biāo)簽的使用仍然是有價(jià)值的，有時(shí)是必要的?？紤]到這一需要，在選擇蛋白質(zhì)純化的親和標(biāo)簽和去除標(biāo)簽的工具方面有了許多不同的方法。在過(guò)去15年中，載體蛋白與高親和力結(jié)合的IMAC標(biāo)簽的結(jié)合使用有了越來(lái)越多的趨勢(shì)。未來(lái)的趨勢(shì)是使用與高可溶性載體蛋白的N端融合的小分子的親和力標(biāo)簽，促進(jìn)目的蛋白的折疊、溶解、表達(dá)和純化，并進(jìn)行柱上的純化及酶切位點(diǎn)的去除。

參考文獻(xiàn)：

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