近年來，隨著核酸酶介導(dǎo)的靶向基因組編輯技術(shù)迅速發(fā)展，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)可以使基因組DNA雙鏈斷裂（Double-strand breaks, DSBs），從而進行DNA修復(fù)，修復(fù)途徑主要包括非同源末端連接修復(fù)（Non-homologous end-joining, NHEJ）和同源重組修復(fù)（Homologous recombination,HR）兩種，但是還存在有其它的非同源重組修復(fù)途徑，例如微同源末端連接（MMEJ，Microhomology-mediatedend joining）和單鏈退火途徑（Single-strand annealing SSA）（圖1）。

圖1 非同源修復(fù)的三種途徑(McVeyM et al.;2008)

綠色方框代表需要識別的同源序列

近日，美國馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Scot A. Wolfe團隊和Charles P. Emerson Jr團隊合作在Nature在線發(fā)表了一篇題為'Precise therapeutic gene correction by a simple nuclease-induced double-stranded break'的文章，描述了一種基于微同源末端連接（MMEJ）的修復(fù)途徑對基因組上致病性微重復(fù)中心附近區(qū)域進行修復(fù)編輯，修正肢帶型肌營養(yǎng)不良2G型(limb-girdle muscular dystrophy type 2G,LGMD2G)和白化病亞型Hermansky-Pudlak綜合征1型(Hermansky–Pudlaksyndrome type 1,HPS1)的基因序列，實現(xiàn)了精確恢復(fù)野生型基因序列的目的（圖2），同時評估了基于MMEJ修復(fù)方式的有效性。

圖2 致病性8-bp微重復(fù)TCAP(粗體紅色和藍色文本)。紅色框內(nèi)為SpCas9PAM序列，下劃線為sgRNA.紅色箭頭表明CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的DSB的位點，半紅半藍文本為修復(fù)后的野生型序列。

鑒于此文：NHEJ的這三種方式有什么的區(qū)別？它的修復(fù)原理是否已經(jīng)闡明?下面來簡單介紹一下這幾種修復(fù)方式的區(qū)別及NHEJ修復(fù)機制的過程。

NHEJ途徑修復(fù)DSB損傷是通過末端直接相連的方式進行的，這種連接不需要大片段的同源序列識別，而只需要1-5bp的堿基配對就可以進行修復(fù)，屬于一種易錯修復(fù)。2016年，阿姆斯特丹自由大學(xué)的Erwin Peterman和Gijs Wuite在Nature發(fā)表的文章”Sliding sleeves of XRCC4–XLF bridge DNA and connect fragments of broken DNA”闡述了NHEJ修復(fù)的機制，弄清了NHEJ是如何修復(fù)雙鏈DNA斷裂的，發(fā)現(xiàn)NHEJ在修復(fù)過程中的兩種蛋白質(zhì)（XLF和XRCC4）可以捕獲斷裂雙鏈DNA的損傷末端，并將它們結(jié)合在一個高度穩(wěn)定，但卻可以移動的復(fù)合物中，就像帶粘性的“袖子”，覆蓋并沿DNA兩端滑動，這兩個蛋白參與將兩個斷裂的DNA末端集合在一起（圖3）。

圖3 XRCC4(綠色)和XLF(紅色)在DSB后橋接和結(jié)合DNA片段(灰色)的機制。

      同年，中國科學(xué)院高彩霞研究組和李家洋研究組在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)NHEJ修復(fù)機制于水稻基因進行定點替換及插入，利用建立的基因定點替換和定點插入兩種策略，實現(xiàn)了水稻內(nèi)源OsEPSPS基因保守區(qū)兩個氨基酸的定點替換，相關(guān)成果'Gene replacements and insertions in rice by intron targeting using CRISPR–Cas9'發(fā)表在Nature Plants上(圖4)。

圖4 利用CRISPR/Cas9技術(shù)通過堿基替換策略獲得草甘膦抗性的水稻材料

與NHEJ修復(fù)途徑比較，MMEJ修復(fù)與其最大的差別在于所識別的同源序列長度的不同，MMEJ修復(fù)途徑需要5-25個堿基同源序列(圖1，圖2a)。常常會造成連接處發(fā)生同源片段的缺失或者基因重排，也是一種易錯的修復(fù)方式。因此，盡管MMEJ在修復(fù)模式上類似于NHEJ,但仍然是一種完全獨立的NHEJ途徑的修復(fù)模式。

與NHEJ和MMEJ途徑相比較，SSA途徑需要更長的同源序列(>30bp)來進行識別，其類似于MMEJ途徑的是，SSA途徑可以導(dǎo)致基因組的缺失；此外，SSA與同源重組途徑類似，也被歸屬為同源序列依賴型的DSB修復(fù)模式，兩者都需要通過5’到3’的DNA剪切，產(chǎn)生3’突出的單鏈ＤＮＡ。2018年6月，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所夏蘭琴實驗室與華中農(nóng)業(yè)趙云德教授實驗室合作的題為“Synthesis-dependent repair of Cpf1-induced double-strand DNA breaks enables targeted gene replacement in rice”的研究論文，就是利用合成依賴性修復(fù)機制在水稻中實現(xiàn)了ALS基因的等位基因替換，獲得了抗除草劑水稻(圖5)。

圖5 利用合成依賴性修復(fù)機制實現(xiàn)ALS基因的等位基因替換

同樣，這三種修復(fù)方式在動植物中也實現(xiàn)了定向插入外源性供體DNA或者基因堿基的替換，在這里就不一一進行介紹了，隨著科學(xué)技術(shù)的進步，不論是同源修復(fù)途徑還是非同源修復(fù)途徑，在未來必將會成為治療疾病，改良性狀等有效的技術(shù)手段。