線粒體病是因線粒體DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）或核DNA（nuclear DNA, nDNA）的遺傳缺陷引起線粒體氧化磷酸化功能障礙、ATP合成不足，而引起的一組可累及多系統(tǒng)的疾病。常見的線粒體病亞型如線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作（mitochondrial encephalomyopathy，lactic acidosis，and stroke-like episodes，MELAS）、肌陣攣性癲癇伴破碎紅纖維（myoclonic epilepsy with ragged-red fibers，MERRF）的常見突變類型為mtDNA的點(diǎn)突變；而Kearns-Sayre綜合征（Kearns-Sayre syndrome，KSS）和慢性進(jìn)行性眼外肌癱瘓（chronic progressive external ophthalmoplegia, CPEO）的常見突變類型為mtDNA的大片段缺失。mtDNA片段缺失包括單一缺失和多發(fā)缺失，其中多發(fā)性片段缺失多為參與mtDNA復(fù)制或修復(fù)的nDNA缺陷導(dǎo)致的繼發(fā)性改變，包括POLG[γ-多聚酶（polymerase gamma）]、ANT1、C10orf2、TP等核基因^[1]。POLG編碼DNA多聚酶γ，是線粒體內(nèi)唯一的DNA聚合酶，由POLG（POLG1）基因編碼的一個(gè)催化亞基（p140）和由POLG2基因編碼的兩個(gè)輔亞基（p50）組成。POLG基因突變將導(dǎo)致DNA多聚酶γ的催化活性、持續(xù)合成能力以及與DNA結(jié)合能力嚴(yán)重下降，影響mtDNA的保真性復(fù)制以及mtDNA結(jié)構(gòu)完整性的維護(hù)，導(dǎo)致mtDNA的多發(fā)性片段缺失、多發(fā)點(diǎn)突變或拷貝數(shù)量減少、線粒體功能異常從而引發(fā)線粒體疾病^[2]。自2001年Fadic等首次發(fā)現(xiàn)POLG基因突變造成的進(jìn)行性眼外肌麻痹（progressive external ophthalmoplegia, PEO）之后^[3]，相繼有文獻(xiàn)報(bào)道POLG基因突變可導(dǎo)致常染色體隱性PEO（arPEO）和顯性PEO（adPEO）^[3,4]、感覺性共濟(jì)失調(diào)神經(jīng)病伴構(gòu)音障礙和眼外肌癱瘓（sensory ataxic neuropathy，dysarthria and ophthalmoparesis，SANDO）^[5]、常染色體隱性遺傳性共濟(jì)失調(diào)^[6,7]、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)伴癲癇^[8]等多種表型。但到目前為止，國內(nèi)罕有POLG基因突變所致病例的報(bào)道。在此我們報(bào)道5例POLG基因突變所致線粒體疾病患者，并分析其臨床、電生理、病理和基因突變特點(diǎn)。

資料和方法

一、臨床資料

回顧性收集2012年4月至2018年1月在北京大學(xué)第一醫(yī)院就診的5例線粒體病患者，5例患者之間無血緣關(guān)系，總結(jié)其臨床資料。在獲得患者或其監(jiān)護(hù)人的知情同意后，對患者進(jìn)行骨骼肌或腓腸神經(jīng)活體組織檢查（活檢），對所有患者及部分家系成員進(jìn)行基因檢測。

二、研究方法

1．肌肉和神經(jīng)活檢：

肌肉標(biāo)本在液氮預(yù)冷的異戊烷中快速冰凍固定，冷凍切片，進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)、酶組織化學(xué)染色，包括蘇木精-伊紅（HE）、改良Gomori三色（MGT）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、還原型輔酶Ⅰ四氮唑還原酶（NADH）、細(xì)胞色素c氧化酶（COX）、三磷酸腺苷酶（ATPase）染色等。腓腸神經(jīng)活檢標(biāo)本一部分經(jīng)4%的甲醛固定后，石蠟包埋和切片，常規(guī)進(jìn)行HE、快藍(lán)髓鞘和剛果紅染色。另一部分標(biāo)本在2%的戊二醛中固定，1%的餓酸后固定，常規(guī)脫水和塑料包埋，半薄切片甲苯胺藍(lán)染色，超薄切片進(jìn)行電鏡觀察。

2．基因檢測：

對5例患者采取外周血5 ml，用鹽析法提取基因組DNA，送基因檢測公司利用靶向二代測序技術(shù)分析線粒體病相關(guān)核基因。對發(fā)現(xiàn)的可疑致病突變位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測序和家系驗(yàn)證。對文獻(xiàn)未報(bào)道的新突變進(jìn)行種系進(jìn)化保守性分析，在ExAc數(shù)據(jù)庫檢索其人群攜帶率，用SIFT、Polyphen2、Mutationtaster等生物信息學(xué)軟件預(yù)測其致病意義。

結(jié)果

一、患者臨床資料

例1　男性，50歲，于2012年4月就診我院。10年前逐漸出現(xiàn)雙足麻木、雙足踩棉感、行走不穩(wěn)，有時(shí)穿鞋上床而不自知。5年前出現(xiàn)雙眼瞼下垂，晨起或休息后略減輕，同時(shí)伴隨視物模糊。曾經(jīng)診為'左眼青光眼和白內(nèi)障'。3年前進(jìn)行左眼白內(nèi)障手術(shù)治療，術(shù)后視物模糊改善。1年前雙下肢麻木發(fā)展到大腿中部，伴隨雙手麻木，無法進(jìn)行精細(xì)活動(dòng)。行走不穩(wěn)癥狀更為明顯，但尚能蹲起、獨(dú)立行走及上臺(tái)階。否認(rèn)家族中類似發(fā)病者。體格檢查：身高172 cm，體重62 kg，構(gòu)音清晰，雙上瞼下垂，上瞼遮蓋瞳孔上部1/3，雙眼球各方向活動(dòng)均受限，僅可活動(dòng)約3 mm，無復(fù)視。雙手掌指關(guān)節(jié)遠(yuǎn)端痛、觸覺減退，雙大腿中部以下痛、觸覺減退。雙膝關(guān)節(jié)以下音叉振動(dòng)覺消失，雙足趾關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)覺消失。頸屈肌力Ⅳ級。屈髖肌力Ⅴ^-級，其余肌力Ⅴ級。雙上肢共濟(jì)運(yùn)動(dòng)正常，雙下肢跟膝脛試驗(yàn)欠穩(wěn)準(zhǔn)。行走時(shí)步基略寬，閉目難立征陽性。四肢腱反射消失，雙下肢病理征陰性。血清乳酸2.8 mmol/L（正常值0.5~2.0 mmol/L），血清肌酸激酶332 IU/L（正常值38~174 IU/L）。心電圖示預(yù)激綜合征（WPW）A型。針極肌電圖示肌肉呈神經(jīng)源性損害，感覺神經(jīng)傳導(dǎo)檢測雙正中、橈、腓淺、腓腸神經(jīng)感覺神經(jīng)動(dòng)作電位（SNAP）均未引出。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)顯示左腓總神經(jīng)和雙正中神經(jīng)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度（MNCV）均正常，右腓總神經(jīng)MNCV輕度下降（37 m/s），遠(yuǎn)端潛伏期（DML）延長（7.4 m/s），復(fù)合肌肉動(dòng)作電位（CMAP）波幅下降（1.0 mV）。頭顱MRI未見明顯異常。

例2　男性，47歲，于2016年11月就診我院。10年前開始出現(xiàn)蹲起費(fèi)力和上樓費(fèi)力，行走時(shí)易摔倒，4年前逐漸出現(xiàn)雙側(cè)眼瞼下垂，伴隨發(fā)音不清，偶有進(jìn)食吞咽困難。家族史陽性，患者的母親、舅舅和妹妹有類似臨床表現(xiàn)。體格檢查：輕度構(gòu)音障礙，雙上瞼下垂，眼球上視輕度受限，余方向活動(dòng)正常。四肢深淺感覺無異常，頸屈?、?sup>-級，上肢肌力Ⅴ級，下肢近端肌力Ⅳ級，足背伸肌力Ⅱ級，跖屈肌力正常。四肢腱反射減低，病理征陰性。血清肌酸激酶945 U/L。周圍神經(jīng)傳導(dǎo)檢測未見異常。

例3　女性，28歲，于2016年6月就診我院。4年前開始出現(xiàn)雙眼瞼下垂，伴隨眼球活動(dòng)障礙，沒有復(fù)視，2年前出現(xiàn)四肢力弱，表現(xiàn)為上肢上舉費(fèi)力，上樓和蹲起費(fèi)力。1年前行雙側(cè)上瞼下垂矯正術(shù)。家族中沒有類似發(fā)病者。體格檢查：發(fā)音清晰，雙眼瞼下垂，上瞼遮蓋瞳孔上部1/3，雙側(cè)眼球各向活動(dòng)障礙，活動(dòng)度約3 mm。四肢感覺無異常，頸屈?、蠹?，上肢肌力近端Ⅳ⁺級，屈腕、伸腕肌力Ⅳ級，雙手握力正常，下肢屈髖肌力Ⅳ⁺級，遠(yuǎn)端正常。四肢腱反射消失，病理征陰性。針極肌電圖顯示肌肉呈肌源性損害。周圍神經(jīng)傳導(dǎo)檢測未見異常。

例4　女性，61歲，于2018年1月就診我院。26年前出現(xiàn)上瞼下垂，無晨輕暮重現(xiàn)象，19年前眼瞼下垂遮擋瞳孔行雙側(cè)上瞼上提手術(shù)。11年前開始出現(xiàn)全身乏力，行走易疲勞，4年前逐漸出現(xiàn)蹲起費(fèi)力，需雙手輔助方能起身?；颊哂幸慌?，28歲，8年前診斷為'卵巢早衰'，4年前出現(xiàn)眼瞼下垂，無眼球活動(dòng)障礙、肢體無力及吞咽困難。家族中其他人無類似表現(xiàn)。例4的體格檢查顯示：全身均勻性消瘦。講話清晰，雙側(cè)上瞼下垂，眼球上視活動(dòng)差，其余各向運(yùn)動(dòng)充分，閉目輕度力弱。四肢深淺感覺無異常。頸屈肌力Ⅲ^-級，上肢近端肌力Ⅳ級，下肢近端肌力Ⅳ級，四肢遠(yuǎn)端肌力無異常。雙下肢腱反射未引出，病理征陰性。血清肌酸激酶正常。針極肌電顯示右側(cè)股四頭肌、左側(cè)胸鎖乳突肌呈肌源性損害。周圍神經(jīng)傳導(dǎo)檢測正常。頭顱MRI未見明顯異常。

例5　男性，16歲，于2014年3月就診我院。自幼智力發(fā)育落后，1年前出現(xiàn)四肢無力，表現(xiàn)為行走緩慢，上臺(tái)階和蹲起費(fèi)力，伴隨上肢上舉費(fèi)力。否認(rèn)家族中有類似發(fā)病者?；颊吒改笧榻H結(jié)婚。體格檢查：高弓足，跟腱攣縮。智力差，腦神經(jīng)無異常。四肢感覺體檢欠配合。雙上肢近端肌力Ⅳ級，雙手肌力Ⅴ級，雙手平舉時(shí)可見細(xì)小震顫，雙下肢近端肌力Ⅳ^-級，足背伸Ⅳ級。無明顯肌肉萎縮。四肢腱反射未引出，病理征陰性。心電圖正常。電生理檢查，感覺神經(jīng)傳導(dǎo)雙尺神經(jīng)、雙腓腸神經(jīng)、左腓淺神經(jīng)SNAP未引出，左正中神經(jīng)感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度（SCV）輕度下降（45.3 m/s），右正中神經(jīng)SCV輕度下降（47.2 m/s），右腓淺神經(jīng)SCV下降（57.3 m/s）。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢測雙正中神經(jīng)DML延長（左右側(cè)分別為4.11、4.32 ms）。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度正常，右側(cè)脛神經(jīng)CMAP波幅減低（2.9 mV）。頭顱MRI未見明顯異常。

5例POLG基因突變所致線粒體病患者主要臨床特點(diǎn)見表1。

二、病理檢查結(jié)果

例1~4及例4女兒骨骼肌活檢均可見破碎紅纖維（RRFs）、SDH深染的破碎藍(lán)纖維（RBFs）以及COX陰性肌纖維（圖1B、圖1C）。例1同時(shí)出現(xiàn)散在或成小組分布的小角狀萎縮肌纖維（圖1A）。

圖1 例1（A）和例2（B、C）的肌肉病理結(jié)果

A：HE染色顯示少數(shù)肌纖維出現(xiàn)嗜堿性改變和角狀萎縮肌纖維；B：琥珀酸脫氫酶染色顯示深染的破碎藍(lán)纖維（箭頭）；C：琥珀酸脫氫酶/細(xì)胞色素c氧化酶雙染色可見較多的細(xì)胞色素c氧化酶陰性肌纖維（藍(lán)色肌纖維）

例5的腓腸神經(jīng)活檢示有髓神經(jīng)纖維中~重度減少，可見個(gè)別再生簇（圖2A）。電鏡示有髓神經(jīng)纖維軸索內(nèi)線粒體空化、微小空泡增加、神經(jīng)絲和神經(jīng)管的結(jié)構(gòu)紊亂（圖2B）。

圖2 例5的腓腸神經(jīng)活體組織檢查結(jié)果

A:甲苯胺藍(lán)染色顯示有髓神經(jīng)纖維減少，可見個(gè)別有髓神經(jīng)纖維再生簇（箭頭）；B：電鏡下可見有髓神經(jīng)纖維軸索內(nèi)線粒體空泡化、微小空泡增加、神經(jīng)絲和神經(jīng)管的結(jié)構(gòu)紊亂

三、分子生物學(xué)檢查結(jié)果

例1存在POLG c.2591 A>G（p.N864S）和c.1790 G>A（p.R597Q）復(fù)合雜合突變（圖3A、圖3B），其弟弟正常，僅攜帶c.2591A>G（p.N864S）單一雜合突變；例2存在c.914 G>A（p.S305N）單一雜合突變（圖3C），其母親與先證者含有相同位點(diǎn)雜合突變；例3出現(xiàn)c.924G>T（p.Q308H）（圖3D）和c.3002delG（p.G1001fs）復(fù)合雜合突變，家系驗(yàn)證這兩種突變分別來自其父母；例4出現(xiàn)c.2864A>G（p.Y955C）單一雜合突變，其女兒也攜帶該突變；例5存在c.1613A>T（p.E538V）和c.1612 G>T（p.E538^*）復(fù)合雜合突變。其中例1的c.1790 G>A、例2的c.914G>A、例3的c.924G>T、c.3002delG和例5的c.1613A>T、c.1612 G>T為新突變。ExAc數(shù)據(jù)庫顯示這6種突變的人群突變攜帶率極低（其中c.1790 G>A為2.0357E-05，c.914G>A為8.2512E-06，c.1613A>T為1.6244E-05，c.924G>T為8.340E-06，未發(fā)現(xiàn)c.1612 G>T具有攜帶率）。種系同源序列分析顯示新發(fā)突變氨基酸位點(diǎn)S305N、R597Q、Q308H、E538V在種系發(fā)生上具有高度保守性（圖4）。SIFT、Polyphen2、Mutationtaster生物信息學(xué)軟件預(yù)測其具有致病性（表2）。

圖3 部分患者POLG基因Sanger測序結(jié)果

例1的c.2591 A>G（A）及c.1790 G>A（B）復(fù)合雜合突變；例2的c.914 G>A單一雜合突變（C）；例3的c.924G>T單一雜合突變（D）

圖4 不同種屬間氨基酸保守性分析顯示POLG蛋白突變氨基酸位點(diǎn)（S305N、R597Q、Q308H、E538V）呈現(xiàn)高度種系進(jìn)化保守性

討論

本研究的5例患者均存在POLG基因突變，在2例顯性遺傳的先證者檢測到單一雜合突變，在3例散發(fā)患者中檢測到復(fù)合雜合突變。在檢測到的8個(gè)POLG基因突變中有2個(gè)突變?yōu)橐阎虏⊥蛔?，已?bào)道c.2591 A>G（p.N864S）突變導(dǎo)致SANDO ^[6]，c.2864A>G（p.Y955C）突變導(dǎo)致PEO ^[3]。其他6個(gè)突變?yōu)樾峦蛔?。在這6個(gè)新突變中，c.3002delG和c.1612 G>T（p.E538^*）分別為移碼突變和終止突變，其致病可能性較大。曾有文獻(xiàn)報(bào)道c.924G>C(p.Q308H）導(dǎo)致PEO^[5]，我們發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)出現(xiàn)G>T，其氨基酸也是p.Q308H，在家系驗(yàn)證中存在基因型和表型共分離現(xiàn)象，支持c.924G>T是致病性突變。c.914G>A（p.S305N）、c.1790 G>A（p.R597Q）和c.1613A>T（p.E538V）為錯(cuò)義突變，ExAc數(shù)據(jù)庫顯示這幾個(gè)突變的人群攜帶率極低，種系發(fā)生中具有高度保守性，生物軟件也預(yù)測其致病性可能性大。病理檢查發(fā)現(xiàn)例1~4的骨骼肌及例5的腓腸神經(jīng)均存在線粒體形態(tài)異常的病理依據(jù)，也支持POLG基因突變導(dǎo)致的線粒體病的診斷。

該組患者的例1主要表現(xiàn)為中年隱襲起病、慢性進(jìn)行性加重的感覺性共濟(jì)失調(diào)伴眼外肌麻痹，缺乏構(gòu)音障礙，符合不完全型SANDO的臨床表現(xiàn)。SANDO這組臨床三聯(lián)征最早在1997年由Fadic等^[9]首次報(bào)道，2003年Van Goethem等發(fā)現(xiàn)其致病基因?yàn)镻OLG基因^[10]。此外，也有C10orf2、ANT1等基因所致SANDO的報(bào)道^[11]。SANDO可表現(xiàn)為完全型、不完全型或疊加綜合征。起病年齡通常在16~53歲，大部分患者為逐漸緩慢進(jìn)展，遺傳方式包括散發(fā)、常染色體隱性、常染色體顯性。首發(fā)癥狀以感覺性共濟(jì)失調(diào)、步態(tài)不穩(wěn)最為常見，隨疾病發(fā)展可出現(xiàn)瞼下垂、眼外肌麻痹、運(yùn)動(dòng)不耐受、構(gòu)音及吞咽障礙、癲癇發(fā)作、認(rèn)知功能下降及其他多系統(tǒng)如內(nèi)分泌、心臟、消化道、自主神經(jīng)等受累的多種臨床表現(xiàn)^{[10,12,13,14,15,16]}，SANDO的核心癥狀為感覺性共濟(jì)失調(diào)和眼外肌麻痹。文獻(xiàn)報(bào)道心臟受累可表現(xiàn)為舒張性心臟病、二尖瓣脫垂等^[15]。而本組例1的心電圖示W(wǎng)PW，提示心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)亦可受累。SANDO神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢測和周圍神經(jīng)病理檢查常提示軸索性神經(jīng)病或神經(jīng)元病，感覺受累更明顯^[16,17]。本組例1患者的周圍神經(jīng)傳導(dǎo)顯示SNAP均未引出，而運(yùn)動(dòng)神經(jīng)受累相對輕，提示該患者為感覺神經(jīng)受累為主的周圍神經(jīng)病，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。Horga等^[18]也提出，在線粒體病眼外肌癱瘓的患者中，如果出現(xiàn)周圍神經(jīng)受累，提示核基因缺陷的可能。雖然例1的肢體肌無力臨床表現(xiàn)不重，但骨骼肌活檢發(fā)現(xiàn)典型的線粒體病改變，為其診斷提供了重要線索。

該組患者的例2~4以成年起病的緩慢進(jìn)展的雙瞼下垂、眼球活動(dòng)障礙以及四肢近端肌無力為主要表現(xiàn)，而沒有顯著的感覺性共濟(jì)失調(diào)，故診斷為PEO疊加綜合征^[4]。這3例患者均屬于家族性PEO，根據(jù)其遺傳方式，例2和例4為adPEO，例3則為arPEO。家族性是POLG、ANT1、C10orf2等核基因突變所致，而散發(fā)性PEO是因mtDNA單一大片段缺失引起。散發(fā)性PEO多于兒童或青少年期發(fā)病，大部分患者癥狀一直局限在眼外??；而家族性PEO一般為成人發(fā)病，除PEO癥狀外，肌無力和運(yùn)動(dòng)不耐受也是常見癥狀，部分患者可疊加出現(xiàn)軸索性周圍神經(jīng)病、聽力下降、共濟(jì)失調(diào)、抑郁、帕金森綜合征、吞咽困難等^[8]。本組的例2出現(xiàn)構(gòu)音障礙、例4的女兒出現(xiàn)卵巢功能早衰均屬于POLG導(dǎo)致的PEO伴隨改變^[8]。

還有報(bào)道POLG與多種其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，包括早發(fā)嬰幼兒起病的致死性Alpers綜合征^[19]、青少年起病的MEMSA（myoclonus epilepsy, myopathy, sensory ataxia,肌陣攣癲癇、肌病、感覺性共濟(jì)失調(diào)）^[19]、成年發(fā)病的MELAS ^[20]以及早發(fā)帕金森綜合征等^[21]。本組例5為青少年起病，以認(rèn)知發(fā)育遲滯和周圍神經(jīng)病為主要臨床表現(xiàn)，沒有眼外肌受累和家族史。電生理及神經(jīng)活檢均提示感覺受累為主的軸索性周圍神經(jīng)病。盡管認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲滯也見于POLG所致腦病患者中^[21]；而POLG導(dǎo)致的單純的感覺運(yùn)動(dòng)性軸索性周圍神經(jīng)病也偶有報(bào)道^[22]，但與例5相似的臨床表現(xiàn)尚未見報(bào)道。我們的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了POLG相關(guān)疾病的臨床譜系（表1）。

總之，本組POLG基因突變相關(guān)線粒體神經(jīng)肌肉病的表型不盡相同，包括不全SANDO、PEO或PEO疊加綜合征、認(rèn)知發(fā)育遲滯伴隨周圍神經(jīng)病，其遺傳方式可以為散發(fā)、顯性或隱性遺傳，盡管POLG相關(guān)疾病具有多樣性，但其臨床癥狀常以PEO、肢體無力、軸索性感覺性神經(jīng)病等較為常見。神經(jīng)肌肉病理檢查和基因檢測有助于明確診斷。