微生物組研究中優(yōu)化方法和規(guī)避誤區(qū)

2017年五月發(fā)表在Microbiome上的綜述，對(duì)于老司機(jī)會(huì)有很多共鳴，對(duì)于新人更要必讀，少走彎路。

微生物組學(xué)研究最大的問題：實(shí)驗(yàn)難重復(fù)。就像古希臘哲學(xué)家赫拉克利特說“人不能兩次踏進(jìn)同一條河流”。微生物組實(shí)時(shí)在變，己有文章表明動(dòng)、植物的細(xì)菌組在晝夜間都有10-20%的部分存在顯著的變化(Cell, 2015; Microbiome, 2016)。反之在自然界，研究對(duì)象的微生組每個(gè)月、每年有多大變化可想而知。因此實(shí)驗(yàn)室的的人工重組實(shí)驗(yàn)是目前可重復(fù)實(shí)驗(yàn)的主要手段。

對(duì)于研究自然對(duì)象的實(shí)驗(yàn)，很多條件我們?cè)谝巴饣蜣r(nóng)田無法控制，如溫度、濕度、降雨等等，它們己知對(duì)微生物群落結(jié)果影響都非常大，但這些并不影響發(fā)現(xiàn)的真正自然規(guī)律。

在科學(xué)實(shí)驗(yàn)中最怕的不是當(dāng)前技術(shù)認(rèn)識(shí)的局限性而導(dǎo)致的誤差或錯(cuò)誤，而是由于人為知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)不足采用了不合理或錯(cuò)誤方法，引入的假陽(yáng)性結(jié)果并把這些假陽(yáng)性結(jié)果當(dāng)成重大發(fā)現(xiàn)去發(fā)表。一般審稿人都是專業(yè)，很容易把關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。但很多低水平雜志，根本找不到高水平的審稿人，大家就馬馬虎虎的審，再發(fā)表，再?zèng)]人看，錯(cuò)了也沒人知道。進(jìn)入了垃圾文章的怪圈。

我還是建議做課題前，還是至少讀相關(guān)文獻(xiàn)100篇，把握主流研究的技術(shù)體系，不至于有明顯錯(cuò)誤。讀10幾篇高水平綜述，比Articles更高效，快速學(xué)習(xí)別人總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)。比如這篇文章指出了很多明顯的常見錯(cuò)誤，希望大家仔細(xì)閱讀，盡量避免，不要等到審稿人指出再改，實(shí)驗(yàn)可就真白做了。

摘要

• 人類微生物組的研究發(fā)現(xiàn)其大量疾病和健康相關(guān)，但仍存在比較多的假陽(yáng)性結(jié)果。

• 本文旨在傳達(dá)關(guān)于優(yōu)化微生物組相關(guān)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、規(guī)避已知誤區(qū)的建議；

• 綜述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中最好的研究方法，介紹動(dòng)物研究中常見的年齡、膳食、抗生素使用、寵物飼養(yǎng)、縱向(時(shí)間上)不穩(wěn)定性和共住期間微生物分享等，并對(duì)幾種樣品類型提出了最好的儲(chǔ)存方法；

• 討論應(yīng)配合實(shí)驗(yàn)樣本的陽(yáng)性和陰性對(duì)照的設(shè)計(jì)和分析，介紹了可用作陽(yáng)性對(duì)照的非生物DNA序列；仔細(xì)分析正負(fù)對(duì)照是非常重要的，因?yàn)槲廴究蓪?dǎo)致部分或全部樣品改變；

• 總結(jié)了通過多重比較的嚴(yán)格控制，及比較發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證性隊(duì)列的方式提高實(shí)驗(yàn)穩(wěn)健性的方法。

• 希望本文總結(jié)的實(shí)驗(yàn)策略可以幫助研究人員有加速研究、避免誤區(qū)。

微生物組實(shí)驗(yàn)計(jì)劃

• 考慮影響因素：抗生素使用、年齡、性別、飲食習(xí)慣、地理和寵物主人

• 考慮時(shí)間梯度上的變化：健康人群腸道菌群時(shí)間梯度上比較穩(wěn)定，但在每天也存在晝夜節(jié)律。人體其它部分不同時(shí)間則變化很大，如陰道菌群可以短期內(nèi)發(fā)生極大變化。

• 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的籠子效果

圖1. 實(shí)例顯示不同籠子可以決定老鼠的真菌類型

考慮樣品收集和處理過程

• 樣品儲(chǔ)存條件

圖2. 主坐標(biāo)軸分析表明不同儲(chǔ)存條件下菌群分析結(jié)果存在明顯差別

• 小樣品量要避免環(huán)境污染

圖3. 試劑盒不同提取方式可導(dǎo)致明顯污染，其中胎盤樣本與負(fù)對(duì)照相似

• 設(shè)置合理的負(fù)對(duì)照

圖4. 負(fù)對(duì)照可展示污染的菌種類

• 設(shè)置合理的正對(duì)照

圖5. 合成非細(xì)菌的16S DNA作為正對(duì)照

• 鳥槍法宏基因組測(cè)序中的染污

圖6. 宏基因組測(cè)序中的污染

分析中要考慮的問題

• 處理負(fù)對(duì)照

• 多重比較控制顯著性和假陽(yáng)性率

• 發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證組雙重檢驗(yàn)提高結(jié)果可信度

英文摘要原文

Research on the human microbiome has yielded numerous insights into health and disease, but also has resulted in a wealth of experimental artifacts. 

Here, we present suggestions for optimizing experimental design and avoiding known pitfalls, organized in the typical order in which studies are carried out. We first review best practices in experimental design and introduce common confounders such as age, diet, antibiotic use, pet ownership, longitudinal instability, and microbial sharing during cohousing in animal studies. Typically, samples will need to be stored, so we provide data on best practices for several sample types. We then discuss design and analysis of positive and negative controls, which should always be run with experimental samples. We introduce a convenient set of non-biological DNA sequences that can be useful as positive controls for high-volume analysis. Careful analysis of negative and positive controls is particularly important in studies of samples with low microbial biomass, where contamination can comprise most or all of a sample. Lastly, we summarize approaches to enhancing experimental robustness by careful control of multiple comparisons and to comparing discovery and validation cohorts. 

We hope the experimental tactics summarized here will help researchers in this exciting field advance their studies efficiently while avoiding errors.

Reference

1. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research DOI: 10.1186/s40168-017-0267-5 https://microbiomejournal./articles/10.1186/s40168-017-0267-5

2. http://www./papers/read/1062523140?kf=xread_daily