作者：姜佳偉/魯軒轅

來源：科研小助手

簡介
骨關(guān)節(jié)炎(OA)是最常見的退行性關(guān)節(jié)疾病，但其病因機(jī)制尚不完全清楚。本文中我們展示了NUDT 7在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用。在正常人軟骨細(xì)胞中敲除NUDT 7可導(dǎo)致脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的破壞。

此外，Nudt 7?/?小鼠表現(xiàn)出明顯的脂質(zhì)積累，這主要是因為過氧化物酶體功能障礙、IL-1β表達(dá)上調(diào)和誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的。我們的基因組分析顯示NUDT 7基因敲除會影響糖酵解途徑，而且Pgam1是一個發(fā)生顯著改變的基因。在軟骨細(xì)胞中的過表達(dá)PGAM 1可誘導(dǎo)脂質(zhì)的積累、IL-1β表達(dá)的上調(diào)和細(xì)胞凋亡，這與抑制NUDT 7得到的結(jié)果是一致的。

除此之外，當(dāng)同時過表達(dá)NUDT 7后，PGAM 1負(fù)性調(diào)控軟骨穩(wěn)態(tài)的作用能夠被逆轉(zhuǎn)。我們的結(jié)果提示NUDT 7可能成為調(diào)控軟骨退變相關(guān)疾病的潛在治療靶點(diǎn)。

研究背景
骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨和滑膜炎癥逐漸退化為特征的退行性關(guān)節(jié)疾病,對全世界老年人造成巨大的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中特有的細(xì)胞類型，通過調(diào)節(jié)合成代謝和分解代謝途徑來維持軟骨的穩(wěn)態(tài)。

分解代謝途徑調(diào)節(jié)因子激活可導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、崩解素（disintegrin）和含凝血酶素基序的金屬蛋白酶(ADAMTS)的釋放，最終導(dǎo)致軟骨的破壞和軟骨細(xì)胞凋亡?，F(xiàn)階段研究已經(jīng)在OA發(fā)病過程中發(fā)現(xiàn)了許多導(dǎo)致分解代謝和合成代謝途徑失衡的危險因素，但其關(guān)鍵的分子調(diào)節(jié)因子及其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

過氧化物酶體已知參與多種代謝途徑，例如長鏈脂肪酸的β氧化、醚脂合成、膽汁酸代謝和活性氧代謝(ROS)。過氧化物酶體功能失調(diào)主要是由于過氧化物酶體的生物發(fā)生缺陷或過氧化物酶的缺陷所致。

核水解酶是一種過氧化物酶，具有從細(xì)胞中去除有毒核苷酸代謝產(chǎn)物和調(diào)節(jié)多種不同核苷酸底物、輔助性因子和信號分子濃度的功能。在核水解酶中，酶家族成員7（NUDT 7）是一種輔酶A(CoA)二磷酸酶，能夠介導(dǎo)CoA的斷裂。

NUDT 7能夠消除潛在有毒的核苷酸代謝物，如過氧化物酶體中的β氧化產(chǎn)物，以及核苷酸二磷酸衍生物，如NAD+、NADH和核糖ADP。NUDT 7的細(xì)胞和生物學(xué)功能可能與OA發(fā)病密切相關(guān)，但NUDT 7與OA發(fā)病的關(guān)系尚未得到深入研究。本研究旨在探討NUDT 7在OA發(fā)病中的作用及調(diào)控機(jī)制。

研究思路

一、NUDT7參與骨關(guān)節(jié)炎的病理過程
二、NUDT7-/-小鼠DMM造模后具有典型OA表型
三、NUDT7敲除可誘導(dǎo)未成熟小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的過氧化物酶功能失調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
四、NUDT7可通過調(diào)節(jié)PGAM1來影響糖酵解途徑
五、PGAM1可激活細(xì)胞炎癥因子，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡
六、H3K4me3參與激活PGAM1

研究結(jié)果
1. 作者先收集因膝關(guān)節(jié)炎而行全膝置換術(shù)后標(biāo)本，采取自身對照的方法，將膝關(guān)節(jié)軟骨分為軟骨破壞區(qū)域（OA）與正常區(qū)域（Non-OA）。并對OA及Non-OA區(qū)域進(jìn)行切片染色，發(fā)現(xiàn)OA區(qū)域軟骨破壞嚴(yán)重，同時，OA區(qū)域中反應(yīng)軟骨分解代謝的指標(biāo)（Collagen C1-2C, Aggrecan Neoepitope， MMP 13）表達(dá)量明顯上升（Fig.1a）。

2. 作者團(tuán)隊前期研究表明過氧化物酶功能失調(diào)參與OA病理形成過程并從數(shù)據(jù)庫篩選出94個與OA病理形成相關(guān)的過氧化物酶基因。接著，作者從OA及Non-OA區(qū)域中提取軟骨細(xì)胞，并檢測上述94個基因的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)NUDT7表達(dá)顯著變化。進(jìn)一步免疫組化染色發(fā)現(xiàn)NUDT7在OA中表達(dá)量下降，這些數(shù)據(jù)提示NUDT7可能參與調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。

3. 為了探究NUDT7在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生中的具體作用，作者隨即在軟骨細(xì)胞中沉默NIDT7基因，發(fā)現(xiàn)沉默NUDT7后，軟骨形成指標(biāo)相關(guān)指標(biāo)下降，軟骨分解相關(guān)指標(biāo)上升（Collagen C1-2C, Aggrecan Neoepitope， MMP 13等），同時，軟骨細(xì)胞增殖減少，凋亡增加，過氧化物酶活性減低。(fig.1d-1i)

4. fig1中作者已在體外證明NUDT7能夠參與調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生。為了進(jìn)一步研究NUDT7基因在體內(nèi)的作用，作者構(gòu)建了NUDT7-/-小鼠，并予DMM造模，同時分為給予正常飲食和高植醇飲食。

發(fā)現(xiàn)NUDT7-/- DMM造模組小鼠軟骨退變更為嚴(yán)重，同時，高植醇飲食能加重軟骨退變（fig.2a-2c）。（植醇是植酸的一種代謝產(chǎn)物，可通過通過調(diào)節(jié)脂肪酸代謝而影響過氧化物酶體功能。在喂食植醇的小鼠中，由于處于過氧化物酶體功能應(yīng)激，OA表型更加明顯。）

5. 接著，作者進(jìn)一步探究NUDT7基因在軟骨分化中的作用。作者從出生后5天的NUDT7-/-及NUDT7+/+小鼠中提取軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)5天后，進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，軟骨分解代謝相關(guān)基因檢測以及過氧化物酶相關(guān)表達(dá)。發(fā)現(xiàn)與正常組比較，NUDT7-/-組軟骨細(xì)胞分化能力減弱，細(xì)胞凋亡增加，ATP酶活性減弱，脂質(zhì)含量增加，軟骨分解代謝相關(guān)基因表達(dá)量上升。（fig.2d-2g）

小結(jié)：至此，作者已經(jīng)分別在體內(nèi)及體外證明，NUDT7能夠調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。那么，NUDT7是如何影響下游基因來進(jìn)行調(diào)控的呢？作者進(jìn)一步進(jìn)行研究。

6.為了探究NUDT7下游調(diào)控的靶基因，作者從人OA軟骨細(xì)胞及NUDT7-/-小鼠軟骨細(xì)胞中提取RNA并進(jìn)行了生信分析，發(fā)現(xiàn)糖酵解途徑和游離脂肪酸代謝途徑共存于OA軟骨細(xì)胞、NUDT7-/-小鼠軟骨細(xì)胞中。

通過生信分析，作者聚焦到PGAM1這個基因（PGAM 1是一種糖酵解酶，通過將3-磷酸甘油酸(3-PG)轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸甘油酸(2-PG)，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸.PGAM 1在多種生物反應(yīng)中起著重要的作用，包括能量的產(chǎn)生和核苷酸的生物合成）（fig.3a）。隨即，作者檢測人OA標(biāo)本中PGAM1的表達(dá)量，與對照組相比，OA軟骨細(xì)胞、NUDT7-/-小鼠軟骨細(xì)胞PGAM1的表達(dá)量增加最明顯。（fig.3b-3d）。 

7.作者同時也檢測了KO小鼠中2-PG, acetyl-CoA, and malonyl-CoA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)NUDT7-/-小鼠軟骨細(xì)胞中這些指標(biāo)較對照組增加，側(cè)面佐證在OA軟骨細(xì)胞中，PGAM1被激活。（fig.3e-3g）

8. 炎性細(xì)胞因子（如TNF-α,IL-6,IL-1β）表達(dá)上升是OA的一個重要特點(diǎn)之一。為此，作者檢測了人OA區(qū)域軟骨細(xì)胞及NUDT7-/-組軟骨細(xì)胞中上述因子的表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)與對照組相比，實驗組上述炎癥因子表達(dá)量上升，進(jìn)一步驗證了NUDT7參與調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。（fig.4a-4c）

9. 接著，作者在軟骨細(xì)胞中過表達(dá)PGAM1后，作者檢測OA形成相關(guān)指標(biāo)。發(fā)現(xiàn)與對照組相比，實驗組細(xì)胞增殖能力減弱，凋亡增加，炎癥因子表達(dá)增加，軟骨分解代謝相關(guān)指標(biāo)增加，軟骨合成代謝相關(guān)指標(biāo)較少。（fig.4d-4h）

10. 基因表達(dá)可以通過多種組蛋白修飾來控制，如甲基化和/或乙酰化。在這些組蛋白修飾中，histone 3 lysine specific trimethylation (如H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3, H3K36me3)可以調(diào)控基因表達(dá)。H3K4me3是一個基因表達(dá)激活的標(biāo)志。H3K4me3已知能夠與啟動子結(jié)合，促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄。

作者先檢測了人膝關(guān)節(jié)軟骨與各組小鼠膝關(guān)節(jié)中H3K4me3的表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)與對照組相比，OA組與NUDT7-/-小鼠組關(guān)節(jié)軟骨中H3K4me3表達(dá)量增加（fig5a-5c）。

11. 接著，作者采用染色質(zhì)免疫共沉淀的技術(shù)檢測H3K4me3與PGAM1啟動子區(qū)域的直接結(jié)合作用。發(fā)現(xiàn)NUDT7組小鼠軟骨細(xì)胞H3K4me3與PGAM1啟動子區(qū)域結(jié)合增加。

12. 為了進(jìn)一步研究NUDT7與PGAM1的相互作用，作者在NUDT7-/- 和NUDT7+/+小鼠關(guān)節(jié)中注射一系列慢病毒，檢測各組小鼠骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生情況。具體分組如下：1. NUDT7-/- +contorl；2. NUDT7-/- + shPGAM1；3. NUDT7+/++NUDT7;4. NUDT7+/++NUDT7+ PGAM1。發(fā)現(xiàn):1.PGAM1沉默后，NUDT7-/-小鼠軟骨退化情況減輕。2.過表達(dá)NUDT7能夠挽救過表達(dá)PGAM1后所致的軟骨退化。 

13.同時，作者按照上述分組，在體外進(jìn)行軟骨退化相關(guān)實驗，發(fā)現(xiàn)體外實驗結(jié)果與體內(nèi)結(jié)果一致。

結(jié)論
本文研究發(fā)現(xiàn)NUDT7敲除可引起過氧化物酶功能失調(diào)，從而上調(diào)PAGM1來影響糖酵解過程。NUDT7-PGAM 1-IL-1β軸異常調(diào)控是OA發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控通路之一。

參考文獻(xiàn)：

Song J, Baek I J, Chun C H, et al. Dysregulation of the NUDT7-PGAM1 axis is responsible for chondrocyte death during osteoarthritis pathogenesis[J]. Nature Communications, 2018, 9(1):3427.