遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)是研究和操縱蛋白質(zhì)功能的強(qiáng)有力的工具。該技術(shù)能夠?qū)⒕哂幸环N或者多種功能（如帶有翻譯后修飾的，正交反應(yīng)基團(tuán)的，光交聯(lián)基團(tuán)的，光保護(hù)基團(tuán)）非天然氨基酸定點(diǎn)插入到感興趣的蛋白中。經(jīng)過(guò)科學(xué)家20多年的努力，現(xiàn)在已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)200多種非天然氨基酸的定點(diǎn)插入。但是，很多工程化的氨酰tRNA合成酶都有一個(gè)共同的缺陷：底物選擇性差，也就是可以識(shí)別多種非天然氨基酸。比如p-氰基-L-苯丙氨酰tRNA合成酶(pCNFRS)至少可以識(shí)別18種非天然氨基酸，包括p-氰基-L-苯丙氨酸，p-疊氮基-L-苯丙氨酸以及其它苯環(huán)對(duì)位取代的苯丙氨酸衍生物。因此，當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)含有多種非天然氨基酸，尤其是從同一個(gè)天然氨基酸衍生得到的非天然氨基酸時(shí)，很難實(shí)現(xiàn)對(duì)某一種非天然氨基酸的定點(diǎn)插入。

在本文中，作者采用直接進(jìn)化的策略(如圖1)顯著提高了氨酰tRNA合成酶對(duì)特定非天然氨基酸的選擇性。該策略首先通過(guò)易錯(cuò)PCR建立一個(gè)包含多種TAG突變的氨酰tRNA合成酶庫(kù)，然后在多種非天然氨基酸同時(shí)存在下，進(jìn)行兩輪正向的篩選。第一輪篩選是利用包含TAG的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶及同源的tRNA_CUA找到具有活性的氨酰tRNA合成酶。第二輪篩選則是用帶有TAG的報(bào)告蛋白及同源的tRNA，結(jié)合特定氨基酸的性質(zhì)，通過(guò)流式細(xì)胞儀找到能識(shí)別該氨基酸的氨酰tRNA合成酶。然后將分選出來(lái)的細(xì)菌涂布到LB固體培養(yǎng)基上，通過(guò)GFP的讀通實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證篩選出來(lái)的合成酶對(duì)特定底物的選擇性。以前傳統(tǒng)的篩選方法是基于讀通含有TAG的報(bào)告基因進(jìn)行的篩選，這篇文章發(fā)展的策略是利用流式細(xì)胞儀對(duì)底物選擇性的讀出進(jìn)行的篩選，所以得到的氨酰tRNA合成酶可以區(qū)別結(jié)構(gòu)相似的非天然氨基酸。

      圖1. 兩輪正向進(jìn)化策略的示意圖

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 作者的第一個(gè)案例是，利用該策略提高了p-氰基-L-苯丙氨酰tRNA合成酶 (pCNFRS) 對(duì)底物的選擇性（見(jiàn)圖2）。首先，他們用易錯(cuò)PCR構(gòu)建了4.6*10e7容量的tRNA合成酶突變庫(kù)，通過(guò)第一輪的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶篩選找到能同時(shí)識(shí)別p-疊氮基-L-苯丙氨酸(pAzF)和p-氰基-L-苯丙氨酸(pCNF)的pCNFRS突變體。然后將該突變庫(kù)轉(zhuǎn)入表達(dá)sfGFP-2TAG和同源 tRNACUA的E. coli中，讓細(xì)菌在含有pAzF和pCNF中培養(yǎng)基生長(zhǎng)，隨后加入DBCO-Cy5來(lái)檢測(cè)pAzF在sfGFP中的插入。通過(guò)流式細(xì)胞儀可以分選出兩類細(xì)胞：Cy5+/GFP+的細(xì)胞（該類細(xì)胞中含有主要識(shí)別pAzF的pCNFRS突變體），Cy5-/GFP+的細(xì)胞（該類細(xì)胞中含有主要識(shí)別pCNF的pCNFRS突變體）。然后將分選的細(xì)菌種在只含有pAzF或者pCNF固體培養(yǎng)基中，通過(guò)sfGFP的讀通來(lái)評(píng)估突變體對(duì)底物的選擇性。最后作者找的突變體pAzFRS-1可以高選擇性的插入pAzF。與pCNFRS相比，pAzFRS-1對(duì)pCNF的插入降到2倍以下。

圖2. 對(duì)pAzF選擇性識(shí)別的氨酰tRNA合成酶的進(jìn)化

      另外的一個(gè)案例是，作者用該策略提升Nε-乙酰基-賴氨酰tRNA合成酶 (AcKRS)的底物選擇性(見(jiàn)圖3)。AcKRS除了可以識(shí)別Nε-乙酰基-賴氨酸（AcK），還可以識(shí)別m-碘-L-苯丙氨酸 (mIF)，m-溴-L-苯丙氨酸 (mBrF)，m-三氟甲基-L-苯丙氨酸 (mCF3F)，m-甲氧基-L-苯丙氨酸 (mMeOF)。同樣地，通過(guò)第一輪的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶篩選找到能同時(shí)識(shí)別AcK和mIF的AcKRS的突變體。然后將該突變庫(kù)轉(zhuǎn)入表達(dá)Lpp-OmpA-H3-9TAG-His6和同源 tRNA_CUA的E. coli中，讓細(xì)菌在含有AcK和mIF中培養(yǎng)基生長(zhǎng)，隨后加入anti-His6 (FITC) 和 anti-acetyl H3K9 (PE) 抗體。通過(guò)流式細(xì)胞儀可以分選出兩類細(xì)胞胞：FITC+/PE+的細(xì)胞（該類細(xì)胞中含有主要識(shí)別AcK的AcKRS突變體），F(xiàn)ITC-/PE+的細(xì)胞（該類細(xì)胞中含有主要識(shí)別mIF的AcKRS突變體）。然后將分選的細(xì)菌種在只含有AcK和mIF固體培養(yǎng)基中，通過(guò)sfGFP的讀通來(lái)評(píng)估突變體對(duì)底物的選擇性。最后作者找到的突變體mIFRS-1可以高選擇性的插入mIF。與AcKRS相比，mIFRS-1對(duì)AcK的插入降到7倍以下。

圖3. 對(duì)mIF選擇性識(shí)別的氨酰tRNA合成酶的進(jìn)化

      這兩個(gè)應(yīng)用表明本文中發(fā)展的策略可以作為一個(gè)通用的方法將多特異性的tRNA合成酶進(jìn)化成高選擇性的tRNA合成酶。該課題組未來(lái)的目標(biāo)是利用PTM特異性的抗體進(jìn)化出高選擇性識(shí)別PTM的tRNA合成酶，以及利用和反式環(huán)辛烯反應(yīng)的四嗪探針進(jìn)化出識(shí)別環(huán)辛烯類非天然氨基酸的tRNA合成酶。這個(gè)策略為發(fā)展下一代對(duì)特定ncAA有高選擇性的合成酶提供了思路。