甘草是豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草G. inflataBat.或光果甘草G.glabra L.的干燥根和根莖，具有補脾益氣、清熱解毒等功效，被廣泛應(yīng)用于臨床配方，素有“國老”之稱。甘草酸是甘草中的主要活性成分，具有廣泛的藥理活性^[1]。

細(xì)胞色素P450酶（CYP450）系是一個非常重要的氧化酶

本研究整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和生物信息學(xué)，通過PCR進(jìn)行cDNA末端快速克?。╮apid-amplification of cDNAends，RACE）技術(shù)和克隆重組質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)，成功地從甘草根中克隆了一條尚未報道的甘草細(xì)胞色素P450還原酶基因（CytochromeP450 reductase，GuCPR）（登錄號：MH401048），并結(jié)合相關(guān)的生物信息學(xué)分析，對GuCPR蛋白進(jìn)行了預(yù)測和理化性質(zhì)分析，為下一步的原核表達(dá)與功能驗證提供參考，亦為甘草植物的分子育種、定向培育及活性成分的合成生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1  材料與試劑

1.1  材料

甘草種子由本課題組保存，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系主任劉春生鑒定為豆根植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch. 種子。

1.2  試劑

HS DNA Polymerase購于TaKaRa公司；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；pEASY-BluntZero Cloning Kit、Trans1-T1 E.coli感受態(tài)細(xì)胞、EasyPurePlasmid MiniPrep Kit購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；EASYspin通用植物RNA快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、DNA Marker（BM-2000、BM-5000）購于北京博邁德基因技術(shù)有限公司；LB培養(yǎng)基所需試劑（Tryptone、Yeast Extract、NaCl、瓊脂粉）、濃硫酸購于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；引物合成及測序均由生工生物工程公司完成。

2  方法

2.1  GuCPR基因的克隆

取少量甘草種子，濃硫酸浸泡2 h后用清水反復(fù)沖洗數(shù)十次，清水浸泡過夜后，取出種子輕輕擺放于基質(zhì)土壤上，上層輕輕覆土，2～3 d澆水1次，3周后取小苗根部提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，使用HS DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本課題組前期對甘草進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組深度測序數(shù)據(jù)，獲得多條細(xì)胞色素P450還原酶家族基因，通過數(shù)據(jù)分析篩選得到的基因編碼區(qū)全長序列，運用斯坦福大學(xué)在線引物設(shè)計系統(tǒng)（https://www./primer3）設(shè)計特異性引物：g1F 5’-ATGCAGGATTCAAACTCCATGA- AG-3’；g1R 5’-TCACCATACATCACGCAAATACC- TGCC-3’。擴(kuò)增程序如下：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性30 s；55 ℃退火5 s；72 ℃延伸2 min；35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，切下目的片段進(jìn)行回收純化。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，連接至pEASY-BluntZero Cloning Kit構(gòu)建GuCPR-pEASY克隆重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化Trans1-T1 E. coli感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金有限公司）。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性菌株進(jìn)行測序。

2.2  GuCPR基因的生物信息學(xué)分析

采用NCBI網(wǎng)站ORF finder頁面找到轉(zhuǎn)錄組中基因序列的開放閱讀框（ORF）并翻譯為氨基酸序列；雙向測序結(jié)果采用Conting Express軟件進(jìn)行拼接，得到GuCPR基因全長序列；使用Protparam工具（http://www./tools/protparam.html）預(yù)測基因編碼蛋白的理化性質(zhì)；使用TMHMM（http://www.工具（http://www.cbs./services/ TMHMM/）對蛋白進(jìn)行跨膜預(yù)測和跨膜區(qū)位置計算及分值；使用ProtScale工具（http://ca./ tools/protscale.html）進(jìn)行蛋白親疏水性分析。使用SignalP 4.1Server（http://www.cbs./services/SignalP/）進(jìn)行蛋白信號肽預(yù)測。使用NCBI（http://www.ncbi.nlm./Structure/cdd/wrpsb.cgi）數(shù)據(jù)linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan&group=programs&subgroup=proloc）進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測。使用SWISS-MODEL（http:// swissmodel./repository/）進(jìn)行蛋白質(zhì)三級模擬。采用MEGA 6.0軟件進(jìn)行蛋白序列比對分析。

3  結(jié)果與分析

3.1  GuCPR基因的克隆

RNA提取結(jié)果如圖1所示，18 S和28 S 2條帶清晰明亮，說明提取的RNA質(zhì)量較好，完整性較高。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，使用Conting Express拼接雙向測序結(jié)果，得到2 118 bp的基因全長mRNA序列，編碼705個氨基酸殘基。將獲得的ORF核苷酸序列和氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示，氨基酸序列與豆科植物鷹嘴豆Cicer arietinum L. 的細(xì)胞色素P450還原酶相似性最高，達(dá)到90%。

3.2  GuCPR蛋白理化性質(zhì)的預(yù)測

采用protparam在線分析工具（http://www. /tools/protparam.html）對GuCPR蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，蛋白的相對分子質(zhì)量78 450，編碼705個氨基酸，等電點（pI）為5.19，非極性氨基酸殘基（Asp＋Glu）102個，極性氨基酸殘基（Arg＋Lys）76個，脂溶系數(shù)（Aliphaticindex，AI）為82.87，平均疏水性（grand average of hydropathy，GRAVY）為?0.295（圖2），不穩(wěn)定系數(shù)（II）為45.05，是一個不穩(wěn)定的親水性蛋白。

3.3  GuCPR蛋白信號肽預(yù)測

在起始密碼子后，有一段編碼疏水性氨基酸序列的RNA區(qū)域，負(fù)責(zé)把蛋白質(zhì)引導(dǎo)到細(xì)胞中含不同膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞器內(nèi)，即為信號肽序列。本研究采用在線分析工具SignalP 4.1 server預(yù)測GuCPR的N端信號肽，默認(rèn)參數(shù)下，結(jié)果顯示GuCPR蛋白的D值為0.132（圖3），小于設(shè)定閾值0.500。因此，預(yù)測GuCPR可能不含有信號肽，并非為分泌蛋白且不具有信號識別功能。

3.4  GuCPR 蛋白結(jié)構(gòu)域分析

使用NCBI（http://www.ncbi.nlm./Structure/cdd/

wrpsb.cgi）數(shù)據(jù)庫分析GuCPR蛋白的結(jié)構(gòu)域。結(jié)果顯示GuCPR蛋白在287～691氨基酸序列存在NADPH-cytochromeP450 reductase保守結(jié)構(gòu)域（圖4），屬于細(xì)胞色素P450還原酶超家族。

3.5  GuCPR蛋白跨膜區(qū)預(yù)測

采用TMHMM Server v.2.0進(jìn)行GuCPR的跨膜區(qū)預(yù)測，結(jié)果表明GuCPR有一段跨膜螺旋區(qū)，即蛋白的第44～64 位氨基酸。蛋白第1～43位氨基酸在膜內(nèi)側(cè)，第65～705位氨基酸在膜外側(cè)（圖5）。

3.6  GuCPR蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測

采用ProtCompv. 9.0進(jìn)行GuCPR的亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果表明GuCPR應(yīng)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，綜合打分結(jié)果最高，為9.19（圖6）。

3.7  GuCPR蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

SWISS-MODEL（http://swissmodel./repository/）是一個蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，庫中收錄的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)都是使用SWISS-MODEL同源建模方法（homology-modelling）得來的。利用SWISS-MODEL在線軟件構(gòu)建GuCPR蛋白的三維結(jié)構(gòu)，使用2vg8.1.A作為模板序列，結(jié)果見圖7。

3.8  GuCPR系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過NCBI的blast比對GuCPR蛋白序列，按照相似度從高到低排序，從Genbank中下載現(xiàn)有報道的CPR蛋白質(zhì)序列，采用Clustal W進(jìn)行多重序列比對分析，然后采用MEGA 6.0的Neighbor-Joining（NJ）算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstrap 1 000次分析重復(fù)，圖8）。結(jié)果顯示GuCPR與鷹嘴豆Cicer arietinum L.（CaCPR，XP_004507858.1）、豌豆Pisum sativum L.（PsCPR，AAC09468.2）、地三葉Trifolium subterraneum L.（TsCPR，GAU35209.1）、蒺藜Tribulus terrestris L.（MtCPR，XP_003610109.1）可聚為一支，顯示較近親緣關(guān)系。

4  討論

甘草是在中醫(yī)藥中使用最頻繁的藥材，其主要成分有甘草酸、甘草次酸等三萜類化合物20余種，甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素等黃酮類化合物300余種以及各種多糖類化合物，具有抗炎、抗病毒等活性^[14-15]，目前甘草酸完全依賴于從甘草原植物中提取，過度采挖造成甘草資源嚴(yán)重匱乏，而甘草酸的合成生物學(xué)研究能大大降低甘草資源的消耗，為甘草酸產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供充足的原料，是甘草生態(tài)資源可持續(xù)利用的重要保障。本研究成功克隆了甘草酸生物合成途徑中CPR基因，并結(jié)合相關(guān)的生物信息學(xué)分析，預(yù)測了GuCPR蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示GuCPR基因cDNA全長2 118 bp，編碼705個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量78450，pI為5.19。GuCPR蛋白為非分泌蛋白，不具有信號識別功能。跨膜預(yù)測結(jié)果顯示蛋白的第44～64位氨基酸為跨膜區(qū)，同時，亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，與一般報道的CPR 蛋白的定位結(jié)果一致^[16]。

研究過程中，使用濃硫酸對甘草種子進(jìn)行預(yù)處理，可增加種皮和胚乳的透氣性，以促進(jìn)萌發(fā)，縮短種子的催芽時間。本研究對PCR條件做了優(yōu)化考察，結(jié)果顯示退火溫度與退火時間對擴(kuò)增結(jié)果有顯著影響，嘗試分別使用5 S與30 S，55、58、62、65 ℃梯度退火，結(jié)果顯示退火溫度55 ℃，退火時間5 s條件下擴(kuò)增效果最好，特異性最高。本研究使用零背景克隆載體代替?zhèn)鹘y(tǒng)pMD19-T克隆載體，有效地縮短了實驗時間并提高了陽性克隆菌斑數(shù)目，提高了實驗效率。GuCPR為甘草酸生物合成途徑中的關(guān)鍵基因，本研究為進(jìn)一步表征GuCPR的功能，實現(xiàn)甘草酸多通路生物合成奠定前期基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究從甘草中克隆出GuCPR新基因（登錄號MH401048），并結(jié)合相關(guān)的生物信息學(xué)分析方法對GuCPR蛋白進(jìn)行預(yù)測和性質(zhì)分析，為進(jìn)一步研究該酶的活性與功能提供理論基礎(chǔ)及參考。同時，GuCPR在甘草酸的生物合成途徑中發(fā)揮重要作用，也為解析甘草酸的生物合成途徑奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)（略） 

來  源：孫宇峰，厲  妲，黃  穎，楊曉涵，劉春生. 甘草中新NADPH細(xì)胞色素P450還原酶基因的克隆與相關(guān)生物信息學(xué)分析 [J]. 中草藥, 2019, 50(7):1676-1681.