從原代組織樣本中制備真正的單細胞懸浮液可避免過量的細胞損失并且能夠最大化標記靶細胞，從而優(yōu)化細胞分選。以下實驗步驟概述了如何從脾臟樣本中收集細胞，并制備成單細胞懸液以進行下游細胞分選。

實驗步驟

1. 將脾臟組織轉移到35 mm無菌培養(yǎng)皿（產品號 #27100/27150）中。后續(xù)如需進行細胞分選，在培養(yǎng)皿中加入5 mL推薦培養(yǎng)基（請參閱試劑盒產品說明書）。如解離組織后不需細胞分選，請在培養(yǎng)皿中加入含1 mM EDTA的PBS。

注意: 如同時處理多個脾臟樣本，需使用100 mm培養(yǎng)皿（產品號 #27125/27127），并加入10 mL培養(yǎng)基。

2. 去除脾臟組織上的結締組織或脂肪，注意壞死區(qū)域，并檢查脾臟是否有腫大、變色或病變。記錄起始樣本的狀態(tài)對于后期評估細胞非常重要。

3. 從3 cc無菌注射器（產品號 #28230/28240）中取出活塞/柱塞。使用扁平的末端部分以溫和畫圓的方式研磨脾臟5次。這樣可以破壞脾臟和髓質，釋放脾細胞。

4. 將一個70 μm細胞過濾器（產品號 #27216/27260）置于50 mL無菌錐形管上，并用2 mL推薦培養(yǎng)基潤洗濾網。

注意：細胞可能會黏附于干燥的濾網上，潤洗濾網可以減少這種情況 。

5. 使用潤洗過的5 mL或10 mL移液管將脾細胞吹打均勻。

6. 將上清液和組織從培養(yǎng)皿轉移至潤洗過的70μm細胞過濾器（產品號 #27216/27260）。使用一個新的3 cc無菌注射器的活塞/柱塞，以溫和畫圓的方式使細胞和組織通過濾網。用3 mL推薦培養(yǎng)基沖洗濾網。

• 如需提高回收率，可選擇進行此步驟：

  a. 只將上清液而不要將脾臟組織移入過濾器。在培養(yǎng)皿中另加入5 mL推薦培養(yǎng)基。

  注意：如果一次處理多個脾臟可加入10 mL推薦培養(yǎng)基。

  b. 重復步驟4-6，在培養(yǎng)皿中加入推薦培養(yǎng)基（5 mL或10 mL）直至脾臟組織變白且培養(yǎng)基呈現澄清狀態(tài)。

7. 使用3 mL推薦培養(yǎng)基再次沖洗濾網。

8. 離心300 x g，10分鐘來收集細胞。

9. 小心棄去上清。

10. 輕輕敲擊試管重懸細胞。

11. 如有需要，可在試管中加入40 mL推薦培養(yǎng)基，進行第二次洗滌。重復步驟8-10。

12. 脾細胞可用于下游應用。無需去除紅細胞！

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