定量PCR又被稱Real-time PCR或是Quantitative Real-time PCR（以下簡(jiǎn)稱Q-PCR）。現(xiàn)在很多實(shí)驗(yàn)室都有涉及到這一實(shí)驗(yàn)技術(shù)，這篇文件將講述Q-PCR的原理，實(shí)驗(yàn)過(guò)程以及一些問(wèn)題分析。

Q-PCR是利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。

• 擴(kuò)增曲線：反應(yīng)了Q-PCR動(dòng)態(tài)進(jìn)程的曲線。如圖1

• 熒光閾值：前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），熒光閾值的默認(rèn)設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，如果手動(dòng)設(shè)置則設(shè)置大于熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，進(jìn)入指數(shù)期的最初階段。如圖1

• CT值：PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。如圖1

Ct值定量的數(shù)學(xué)原理

1. 理想的PCR反應(yīng)：

Xn＝X0*2n

n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)；X0起始模板數(shù)量；Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量

2. 非理想的PCR反應(yīng)：

Xn＝X0*(1+En)n

n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)；X0起始模板數(shù)量；Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量；En：擴(kuò)增效率

在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到熒光閾值時(shí)

（1）XCt＝X0*(1＋En)Ct＝M

XCt:：熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個(gè)常數(shù)，定為M

方程式：

（1）兩邊同取對(duì)數(shù)得

（2）Log2M＝Log2X0 *(1＋En)Ct

整理方程式（2）：

Log2X0= Log2M - Ct Log2(1＋En)

因此起始模板量的log值與CT值成線性關(guān)系，模板DNA量越多，熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。

常用熒光定量標(biāo)記方法

1. 非特異性熒光標(biāo)記：SYBR Green I

這是一種最為常用的熒光標(biāo)記。它是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。因此，SYBR Green I的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。如圖2

SYBR Green I 染料法——優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：使用方便，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針；具有價(jià)格優(yōu)勢(shì)

缺點(diǎn)：無(wú)模板特異性；對(duì)引物特異性要求較高；不能進(jìn)行多重定量；靈敏度相對(duì)較低

2. Taqman 探針?lè)?

• 5’ 端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R) ，如FAM、VIC等。如圖3

• 3’ 端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher, Q)。如圖3

• 探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無(wú)熒光，但是Taq酶有5’→3’ 外切核酸酶活性，在PCR進(jìn)行時(shí)，可水解探針將R與Q分開(kāi)，R就能發(fā)熒光。如圖3

Taqman 探針?lè)ā獌?yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：高度特異性；重復(fù)性好；靈敏度高；可進(jìn)行多重定量

缺點(diǎn)：只適合一個(gè)特定的目標(biāo)；委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高；不易找到本底低的探針

Q-PCR引物設(shè)計(jì)原則（主要是SYBRGreen I 染料法，★數(shù)量代表了優(yōu)先程度）

Q-PCR的流程（主要是SYBR Green I 染料法）

1. RNA抽提：利用試劑盒或是傳統(tǒng)的Trizol抽提樣本總RNA。之后利用NanoDrop或是Qubit對(duì)抽提的RNA進(jìn)行濃度測(cè)定，并進(jìn)行電泳檢測(cè)，確定RNA的完整性。

2. 反轉(zhuǎn)錄：每個(gè)樣本根據(jù)濃度選取相同的量進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍混勻后-20℃保存?zhèn)溆谩?

3. Q-PCR：更具不同試劑盒所提供的反應(yīng)體系配置。因?yàn)镾YBR Green染料在強(qiáng)光的照射下會(huì)對(duì)染料造成影響。但是其實(shí)也不用過(guò)分的小心。一般來(lái)說(shuō)Q-PCR的操作環(huán)境要求在沒(méi)有DNA和RNA污染的環(huán)境且沒(méi)有DNA酶。因此需要實(shí)驗(yàn)室有一個(gè)專門的定量房間，如果實(shí)驗(yàn)室條件不允許也可以在超凈臺(tái)中進(jìn)行操作，并佩戴無(wú)菌乳膠手套。由于染料對(duì)光線敏感，操作時(shí)應(yīng)避免強(qiáng)光的照射，如果操作允許，可以適當(dāng)降低環(huán)境燈光亮度，但不必過(guò)分擔(dān)心，主要還是操作過(guò)程要快。加完樣品后上機(jī)PCR。

4. 數(shù)據(jù)分析：主要是看擴(kuò)增曲線，CT值，以及溶解曲線。

以上就是Q-PCR的一個(gè)大致流程，所有實(shí)驗(yàn)中遇到的試劑或是耗材都要求無(wú)菌無(wú)RNase以及DNase。

實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)遇到的問(wèn)題：

• CT值一般來(lái)說(shuō)如何才是理想的？

• 答：一般來(lái)說(shuō)CT值在30以下都可以認(rèn)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可靠的，如果CT值大于30那么基本上可以說(shuō)明該基因沒(méi)有擴(kuò)增。但這也不是絕對(duì)的，還可以通過(guò)分析產(chǎn)物電泳結(jié)果，也可以分析溶解曲線。

• 溶解曲線如何分析？

• 答：一般正常的溶解曲線的峰應(yīng)該出現(xiàn)在80℃以上且有且只有一個(gè)單一的峰，這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可靠的。如下圖。

• 如果出現(xiàn)雙峰，則說(shuō)明有非特異擴(kuò)增或是有引物二聚體（如下圖），這樣就需要電泳檢測(cè)是引物二聚體還是非特異擴(kuò)增。如果是引物二聚體那么可以適當(dāng)降低引物濃度或是提高退火溫度。如果是非特異擴(kuò)增則除了提高退火溫度外還可以重新設(shè)計(jì)新的引物。

• 為什么我的三個(gè)復(fù)孔間的CT值差異巨大？

• 答：這可能是因?yàn)榕渲没鞓雍鬀](méi)有充分混勻，導(dǎo)致三個(gè)復(fù)孔間會(huì)出現(xiàn)差異。還有一種可能就是引物設(shè)計(jì)缺乏特異性或是引物與模板不匹配，這樣也會(huì)導(dǎo)致復(fù)孔的結(jié)果出現(xiàn)差異，建議充分混勻反應(yīng)mix，還是不行則考慮重設(shè)引物。

• 為什么我的內(nèi)參的CT值也很高超過(guò)30？

• 答：先確定你的引物是否來(lái)源于成熟的文獻(xiàn)，也就是排除引物的問(wèn)題。如果確定引物無(wú)為題，那就有可能是RNA的抽提時(shí)出現(xiàn)了降解導(dǎo)致了RNA片段的不完整，這樣就需要重新抽提RNA并反轉(zhuǎn)。如果內(nèi)參基因是自己設(shè)計(jì)的，那就需要重新驗(yàn)證該基因的可行性，盡量選擇成熟有過(guò)驗(yàn)證的內(nèi)參基因。

• 為什么我做的基因包括內(nèi)參基因的溶解曲線都有雙峰？

• 答：這種情況就說(shuō)明有基因組DNA的污染。在反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，cDNA需要進(jìn)行簡(jiǎn)單的基因組排除驗(yàn)證，利用有跨越內(nèi)含子的引物做PCR。模板利用cDNA以及基因組DNA，看條帶大小。一般來(lái)說(shuō)以cDNA為模版的產(chǎn)物小于基因組的產(chǎn)物。條件允許的可以選擇帶有去基因組酶的反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

• 為什么我同一個(gè)基因做不同的樣本有的樣本的CT特別低，擴(kuò)增曲線很早就起峰？

• 答：這是由于模板的起始濃度過(guò)高，可以嘗試稀釋模板，因?yàn)槟０鍧舛冗^(guò)高不利于Q-PCR。