核心原理是基于檢測(cè)DNA合成過程中釋放的焦磷酸，從而鑒別是否有特定核苷酸整合到DNA的合成鏈中而發(fā)展的測(cè)序技術(shù)，因此該測(cè)序技術(shù)亦稱焦磷酸測(cè)序技術(shù)。

首先將DNA待測(cè)樣品打斷成小的片段，并在小片段的兩端加上不同的接頭，通過生物素標(biāo)記的接頭提取單鏈DNA從而構(gòu)建單鏈DNA文庫(kù)，這些單鏈DNA通過接頭序列可特異性地連接到不同的磁珠(磁珠上帶有大量的與接頭序列互補(bǔ)的引物)上，實(shí)現(xiàn)一個(gè)磁珠上只有一條DNA，將磁珠放置在油包水的PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行乳化PCR，擴(kuò)增模板DNA。

將這些磁珠連同其上大量擴(kuò)增的單鏈DNA轉(zhuǎn)移到含有很多小孔的一種稱作叫做PTP平板上，每個(gè)小孔只能容納一個(gè)磁珠，然后開始測(cè)序反應(yīng)。

以磁珠上的單鏈DNA為模板，每次加入一種dNTP，進(jìn)行DNA合成反應(yīng)。如果這種dNTP能與模板配對(duì)并延伸，那么在合成之后會(huì)釋放出焦磷酸基團(tuán)，焦磷酸基團(tuán)會(huì)在腺苷酰硫酸APS的存在下由ATP硫酸化酶催化形成ATP。生成的ATP共同氧化反應(yīng)體系中的熒光素分子并發(fā)光，熒光信號(hào)的有無和強(qiáng)度由CCD照相機(jī)記錄，再經(jīng)過計(jì)算機(jī)分析轉(zhuǎn)換為測(cè)序結(jié)果，每輪反應(yīng)后，由三磷酸腺苷雙磷酸酶去除剩余的dNTP，再進(jìn)行下一輪測(cè)序反應(yīng)。下圖為圖一：工作過程示意圖。

    核心原理是讓四種脫氧核苷酸的堿基上分別鏈接上相應(yīng)顏色的熒光基團(tuán)，3’碳上連接阻斷基團(tuán)，封閉3‘羥基，如圖二，這使得每次只有一個(gè)dNTP能參與DNA的合成，通過在切割位點(diǎn)上斷裂，使熒光基團(tuán)釋放，根據(jù)熒光基團(tuán)顏色即可知哪種dNTP結(jié)合上去，下一輪測(cè)序時(shí)只需去除阻斷基團(tuán)即可繼續(xù)進(jìn)行DNA合成。

    主要流程：把待測(cè)序列打斷成小片段，兩端加接頭，利用接頭進(jìn)行橋式PCR（橋式PCR指在微纖維板上固定有許多兩種與接頭序列互補(bǔ)的小片段DNA，這兩種DNA分別對(duì)應(yīng)兩端的接頭，這些小片段DNA充當(dāng)著引物的作用，并以待測(cè)序列為模板進(jìn)行DNA合成，如圖三），實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增待測(cè)DNA，保證后續(xù)的熒光信號(hào)強(qiáng)度足夠，接著就是核心原理所說的流程，最后讀取熒光信號(hào)。