PiRNA是一類片段大小在26-31nt單鏈小RNA，大部分集中在29-30nt，5’端具有強(qiáng)烈的單磷酸尿嘧啶核苷酸傾向性，3’端（2?-O- methyl）進(jìn)行了甲基化修飾（Kirino et al., 2007）(Fig 1)。

Fig 1 structure of piRNA

已研究的大部分物種中，基因組上散在分布的基因座產(chǎn)生了絕大部分的piRNA，這些基因座被稱為piRNA簇（piRNA cluster）。PiRNA 簇根據(jù)能否從基因組上的兩條鏈或一條鏈產(chǎn)生piRNA而分為雙鏈簇和單鏈簇。單鏈簇piRNA是分布最廣泛的也是默認(rèn)的類型。單鏈簇轉(zhuǎn)錄生成piRNA前體與經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄途徑事實(shí)上是難以區(qū)分的，基于二者都具有以下幾個(gè)轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)：（1）啟動(dòng)子區(qū)域都有H3K4me2 (histon 3 lysin 4 dimethylation )標(biāo)志；（2）轉(zhuǎn)錄由RNA聚合酶Ⅱ（pol Ⅱ）負(fù)責(zé)；（3）經(jīng)典的RNA轉(zhuǎn)錄后加工（5’端帽子修飾、剪切、多聚腺苷酸修飾）（Goriaux C et al., 2014）。單鏈簇轉(zhuǎn)錄模式在果蠅中研究的比較清楚。目前，已發(fā)現(xiàn)的主要有兩個(gè)單鏈簇20A 和 flam （Brennecke J et al., 2007）20A 在體細(xì)胞濾泡細(xì)胞（somatic follicle cell）和生殖細(xì)胞中均表達(dá)，flam 只在濾泡細(xì)胞中表達(dá)。Flam具有幾個(gè)顯著的特點(diǎn)（Fig 2）: (1) 位于常染色質(zhì)和異染色質(zhì)的邊界；（2）flam中含有g(shù)ypsy家族的TEs ；(3) 啟動(dòng)子具有H3K4me2標(biāo)記，簇體具有H3K9me2標(biāo)記。Flam 的轉(zhuǎn)錄需要轉(zhuǎn)錄因子Ci (Cubitus interruptus)的參與，piRNA前體的剪切產(chǎn)生多個(gè)異構(gòu)體，這些異構(gòu)體可以通過UAP56和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nxf1和Nxt1轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中的Yb小體進(jìn)行piRNA的成熟和加工（Fig 3）。

Fig 2   flam cluster in the follicle cells of Drosopbila ovary

Fig 3   the transcription of flam cluster

雙鏈簇是果蠅生殖細(xì)胞中piRNA生成的主要方式。顧名思義，piRNA前體可以從基因組的兩條鏈生成。這種方式有別于經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄方式，是一種啟動(dòng)子 非依賴的轉(zhuǎn)錄方式，并且不需要剪切和多聚腺苷酸形式的加工。多項(xiàng)研究表明，Rhino（特異性的結(jié)合到piRNA簇的H3K9me2標(biāo)記），一種異染色體蛋白1（HP1）的同源物(Yu, B et al., 2015)，是雙鏈簇轉(zhuǎn)錄的靈魂蛋白。Rhino被認(rèn)為是一種“錨”，與Deadlock (Del) 和Cutoff (Cuff) 組成復(fù)合物。Rhino-Del 招募Moonshiner 和TATA box 結(jié)合蛋白相關(guān)因子2（Trf2）到簇的YR元件起始轉(zhuǎn)錄(Malone, C. D. et al,2009; Andersen, P. R et al.,2015 )。Rhino-Del-Cuff通過抑制剪切和轉(zhuǎn)錄終止來確保簇的轉(zhuǎn)錄的不斷延伸。轉(zhuǎn)錄完成后，piRNA前體通UAP5轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)的nuage區(qū)域進(jìn)行加工（Fig4）。

Fig 4    Fly germline dual-strand clusters’s transcriptions

piRNA前體的加工、成熟發(fā)生在特定的亞細(xì)胞區(qū)域，動(dòng)物生殖細(xì)胞中稱作nauge，需要PIWI蛋白的參與（Brennecke J et al.,2007; Lim AK et al., 2007 ）。體細(xì)胞來源的果蠅卵泡細(xì)胞中被所謂的“Yb 小體”替代，位于核膜的胞質(zhì)一側(cè)（Murota Y et al., 2014; Qi H et al., 2011 ）。依據(jù)最新的研究表明，成熟piRNA的生成根據(jù)是否依賴于Zuc而分成兩種途徑，一種是Zuc介導(dǎo)的途徑，另一種是Zuc非依賴的生成途徑。

核酸內(nèi)切酶Zuc/MitoPLD，位于線粒體外膜，通過結(jié)構(gòu)及小RNA遺傳與生信分析表明。其在piRNA生成途徑中的核心地位。Zuc不僅參與到了piRNA 5’端的形成，還直接或間接的參與到3’端的產(chǎn)生（Han, B. W et al., 2015）。隨著piRNA簇每隔25nt進(jìn)行剪切時(shí)，果蠅中Zuc的活性表現(xiàn)出一種顯著的持續(xù)性bi變化。此外，在整個(gè)加工過程中PIWI蛋白都參與其中，但是PIWI的加載和Zuc剪切之間的關(guān)聯(lián)還不清楚。

Zuc介導(dǎo)的途徑主要由以下兩個(gè)階段合作完成：（1）“乒乓循環(huán)機(jī)制”；（2）Zuc依賴的拖尾piRNA生成途徑。“乒乓循環(huán)機(jī)制”剪切piRNA前體轉(zhuǎn)錄本，產(chǎn)生5’ 端單磷酸基團(tuán)的pre-pre-piRNA，為Zuc依賴的拖尾piRNA生成途徑提供底物?！捌古已h(huán)機(jī)制”具體過程（Fig 5 ）：（1）Aub結(jié)合到piRNA（反義鏈）形成復(fù)合物去識(shí)別并剪切轉(zhuǎn)座子mRNA，隨后較短的剪切產(chǎn)物被裝載到Ago3蛋白，發(fā)生剪切并產(chǎn)生Ago3-piRNA（正義鏈）復(fù)合體前體，通過Nbr對(duì)3’端進(jìn)行修飾成熟。成熟的Ago3-piRNA（正義鏈）復(fù)合體識(shí)別和剪切piRNA前體轉(zhuǎn)錄本，剪切的產(chǎn)物又可以起始新一輪的循環(huán)，不斷的產(chǎn)生Zuc依賴的拖尾piRNA生成途徑的底物。整個(gè)循環(huán)過程中，特定的復(fù)合物（如Vasa、Krimp、Qin、Spn-E）的裝載確保剪切產(chǎn)物被裝載到不同的PIWI蛋白（Aub/Ago3）上。PiRNA的生成以3’ 方向的形式進(jìn)行，Zuc以每隔25nt的形式剪切產(chǎn)生拖尾piRNA，該過程中由多個(gè)因子參與其中，但是其中的具體機(jī)制還不清楚（Fig 5 ）。最后，Hen1 對(duì)拖尾piRNA進(jìn)行修飾產(chǎn)生成熟的piRNA。

Fig 5    Biogenesis of  piRNAs  by Zuc-dependent pathway

Zuc非依賴的piRNA生成途徑主要在果蠅的卵巢中發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物和家蠶中很稀有。上文提到，“乒乓循環(huán)機(jī)制”與Zuc介導(dǎo)的途徑共同完成成熟piRNA的產(chǎn)生，事實(shí)上，“乒乓循環(huán)機(jī)制”也可以獨(dú)立發(fā)揮功能。Zuc不存在時(shí)，piRNA 5’ 端通過正常的剪切產(chǎn)生，3’ 端通過Nbr去尾修飾（Hayashi R et al., 2016）。秀麗引桿線蟲（C.elegans）中不存在“乒乓循環(huán)機(jī)制”，piRNA (21U-RNAs) 的產(chǎn)生于25-29nt前體，通過前體前兩個(gè)核苷酸的切除和3’端修飾成熟（Gu W et al., 2012）。

PiRNA首先在生殖細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)大量表達(dá)，其功能是抑制轉(zhuǎn)座子，維持基因組結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。隨著體細(xì)胞和癌細(xì)胞中piRNA的發(fā)現(xiàn)，凸顯了piRNA功能的多樣性和重要性。下文就piRNA已知的幾項(xiàng)主要功能進(jìn)行闡述。

通過研究piRNA序列發(fā)現(xiàn)，生殖系統(tǒng)來源的極大部分piRNA是被從基因間區(qū)轉(zhuǎn)錄出來的，基因間區(qū)序列富集著大量的轉(zhuǎn)座子序列碎片（Gunawardane LS et al., 2007）。PiRNA對(duì)轉(zhuǎn)座子剪切功能的實(shí)現(xiàn)主要體現(xiàn)在piRNA對(duì)反轉(zhuǎn)座子RNA進(jìn)行識(shí)別，識(shí)別后利用核酸內(nèi)切酶活性對(duì)轉(zhuǎn)座子進(jìn)行切割，達(dá)到抑制反轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座目的。

生殖細(xì)胞發(fā)育過程中對(duì)反轉(zhuǎn)座子進(jìn)行調(diào)控是piRNA的主要功能之一。果蠅的卵泡細(xì)胞中，piRNA-PIWI復(fù)合物通過識(shí)別轉(zhuǎn)座子的初生轉(zhuǎn)錄本定位到轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，進(jìn)而招募組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)H1組蛋白進(jìn)行H3K9甲基化修飾從而抑制轉(zhuǎn)錄（Huang XA et al., 2013）。PiRNA也可以通過誘導(dǎo)DNA發(fā)生甲基化而抑制其轉(zhuǎn)座。在小鼠的精細(xì)胞中，piRNA-PIWI復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核后識(shí)別LINE-1的初生轉(zhuǎn)錄本，通過一系列反應(yīng)引起LINE-1 DNA 發(fā)生甲基化抑制其表達(dá)（Aravin AA et al., 2008）。大量研究發(fā)現(xiàn)，piRNA在其生成過程中伴隨著在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)轉(zhuǎn)座子的剪切。這一過程主要通過“乒乓循環(huán)”生成途徑完成（Saito K et al., 2009）。

近期研究表明，piRNA途徑通過組蛋白修飾和DNA甲基化進(jìn)行表觀調(diào)控。果蠅中，PIWI和Aub蛋白被發(fā)現(xiàn)是位置效應(yīng)斑（position-effect variegation）的調(diào)控者，提示piRNA途徑通過促進(jìn)染色體的異染色質(zhì)化沉默基因表達(dá)（Pal-Bhadra,M et al., 2004）。在小鼠的配子發(fā)生中，卵母和精母細(xì)胞階段PIWI和piRNA集中高表達(dá)，而這個(gè)階段恰是這兩種細(xì)胞處于表觀修飾最低水平的狀態(tài)，如DNA甲基化修飾、組蛋白的甲基化修飾等（Sasaki H et al., 2008）。在誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPSC）中也發(fā)現(xiàn)有piRNA的存在。iPSC具有分化成各類細(xì)胞的潛能，其中表觀修飾決定著細(xì)胞分化的命運(yùn)，piRNA與染色體和DNA的表觀修飾有關(guān)，通過參與這一過程，使得細(xì)胞向定向的方向進(jìn)行分化（Wang Y et al ., 2014）。除了對(duì)基因組的轉(zhuǎn)座子區(qū)域進(jìn)行表觀修飾，研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)細(xì)胞中piRNA通過DNA甲基化影響神經(jīng)突觸的可塑性（Rajasethupathy, P et al., 2012）。

piRNA對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控不局限于轉(zhuǎn)座子。果蠅卵巢、小鼠生殖組織、非洲爪蛙卵中發(fā)現(xiàn)一些編碼蛋白的mRNA 3’ UTR區(qū)域同樣可以產(chǎn)生piRNA。這些3’ UTR區(qū)域含有轉(zhuǎn)座子重復(fù)序列，提示，piRNA具有調(diào)控mRNA水平的潛能（Robine, N et al., 2009）。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明，piRNA pathway 與 P-bodies 緊密相連，P-bodies 是一種胞質(zhì)復(fù)合物-參與翻譯調(diào)控。有研究報(bào)道，Ago3 、Aub和Tud 蛋白在生殖細(xì)胞中與P-bodies 蛋白發(fā)生共定位（Thomson, T et al., 2008）。在小鼠中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。Miwi和piRNA被發(fā)現(xiàn)和RNP組分相關(guān)(Grivna, ST et al., 2006）。以上實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象揭示了PIWI-piRNA在轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平可能發(fā)揮重要作用。

癌細(xì)胞和腫瘤組織中發(fā)生的基因變化受到一系列小分子的調(diào)控，其中包括非編碼小RNA。有研究結(jié)果表明，PIWI-piRNA與癌癥存在一定的相關(guān)性。

大量研究發(fā)現(xiàn)，人類PIWI蛋白在多種腫瘤中均有異常表達(dá)，如乳腺癌、胰腺癌、肝癌等 （Lee JH et al., 2006 ; Zeng Y et al., 2011）。但是，PIWI蛋白的異常表達(dá)是如何影響腫瘤的臨床特性卻是未知的。盡管piRNA在癌癥中還未被廣泛研究，但是僅有的少數(shù)研究表明，癌癥中piRNA表達(dá)譜發(fā)生了變化。乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個(gè)特異的piRNA序列，其中差異表達(dá)的有6個(gè)。采用RT-PCR技術(shù)在大樣本中驗(yàn)證，證實(shí)其中4個(gè)確實(shí)發(fā)生了顯著性變化（Huang?G  et al., 2013）。有報(bào)道表明，piR-823在胃癌組織中表達(dá)顯著降低，并且表達(dá)水平與胃癌分期相關(guān)，piR-823水平上調(diào)會(huì)導(dǎo)致胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制（ChengJ et al., 2011）。此外，胃癌患者外周血中piR-823明顯低于對(duì)照組，說明piR-823具有作為胃癌診斷標(biāo)志物的潛能。PiR-823也被證明和多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)。有研究表明piR-823在多發(fā)性骨髓瘤中顯著上調(diào)并與臨床分期呈正相關(guān)。在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞沉默piR-823誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞死亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，piR-823通過表觀修飾抑制抑癌基因的表達(dá)（Yan? H et al., 2015）。piR651被發(fā)現(xiàn)也和胃癌相關(guān)。在胃癌組織中，piR651表達(dá)上調(diào)，上調(diào)水平也與胃癌分期相關(guān)?？勺鳛槲赴┰\斷治療的潛在靶點(diǎn)（Cheng?J, et al., 2011）。

piRNA在腫瘤中異常表達(dá)的現(xiàn)象已多有報(bào)道，但有關(guān)piRNA調(diào)控腫瘤進(jìn)展的機(jī)制研究較少。部分學(xué)者，根據(jù)piRNA在生殖系統(tǒng)中的研究結(jié)果對(duì)其在腫瘤中的機(jī)制進(jìn)行了假設(shè)：

（1）piRNA通過甲基化修飾的表觀調(diào)節(jié)參與到腫瘤的形成中；

（2）piRNA在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)編碼蛋白的腫瘤相關(guān)mRNA進(jìn)行降解；

（3）piRNA與miRNA均為非編碼小RNA，可能也具有與miRNA相似的作用。

目前的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，piRNA在腫瘤中發(fā)揮作用的機(jī)制主要有兩種形式：表觀調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控。

DNA甲基化異常、異染色質(zhì)H3K9me3修飾及轉(zhuǎn)座被發(fā)現(xiàn)參與到腫瘤進(jìn)展中。人類淋巴瘤和乳腺癌細(xì)胞系中，單拷貝piRNA通過不完全結(jié)合到非轉(zhuǎn)座子的靶標(biāo)CpGs的基因組DNA上進(jìn)行基因特異性的DNA 甲基化修飾（Fu, A et al., 2014）。進(jìn)一步研究：使用帶有rs1326306 SNP的piR-021285突變體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)，ARHGAP11A基因的第一個(gè)外顯子的CpG島甲基化水平顯著降低。與轉(zhuǎn)染野生型piRNA的細(xì)胞相比，piR-021285突變體增強(qiáng)了ARHGAP11A基因表達(dá)，因此癌細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)（Fu, A et al., 2015）。果蠅中，PiRNA 還可以通過上調(diào)亞端粒異染色質(zhì)區(qū)域H3K4me3和抑制H3K27me3誘導(dǎo)常染色質(zhì)狀態(tài)來激活基因表達(dá)（Yin, H et al., 2007）。與這種機(jī)制相類似，類piRNA分子，位于生長(zhǎng)抑制特異性基因（Growth Arrest Specific 5, GAS5）內(nèi)含子區(qū)域，與PIWIL1/4一起招募hCMPASS類似復(fù)合物到腫瘤壞死因子家族TRALL的啟動(dòng)子區(qū)域從而激活TRLL的表達(dá)，抑制腫瘤生長(zhǎng)（He, X et al., 2015）。

除了表觀修飾，PiRNA也可以對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控。在人類支氣管上皮細(xì)胞系中敲除piR-L-163后，DNA合成加速，G2-M期轉(zhuǎn)換加速，加快了細(xì)胞的侵襲和遷移能力（He, X et al., 2015）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，piRNA-L-163與磷酸化的蛋白質(zhì)ERM的結(jié)合是其發(fā)揮作用的重要形式，提示，piRNA在肺癌中的功能性作用。上述結(jié)果表明，piRNA在腫瘤中發(fā)揮功能性作用也可以以PIWI非依賴的形式進(jìn)行。