根據(jù)腸鏡和組織學檢查結(jié)果將受試者分為9組：（1）正常（無顯著的結(jié)腸鏡檢查變化）；（2）少量息肉（< 5 mm息肉，最多兩個）；（3）多發(fā)性息肉樣腺瘤伴低度異型增生（MP，超過3個腺瘤，多為5個以上腺瘤）；（4）粘膜內(nèi)癌（高度異型增生的息肉樣腺瘤），0期CRC（S0）；（5）CRC I期；（6）CRC II期；（7）CRC III期；（8）CRC IV期；（9）正常，有結(jié)直腸手術史（HS）。數(shù)據(jù)分析時，將（1）和（2）合并為健康對照。I期和II期CRC的患者合并為I/II期（SI/II），III期和IV期CRC的患者合并為III/IV期（SIII/IV）。

對616名、406名受試者糞便樣本分別進行腸道菌群和代謝組學檢測分析，如Fig.1所示。宏基因組結(jié)果顯示富含Bacteroides的受試者中Prevotella相對豐度低。且616名患者中有118名（19.2％）檢測到Megamonas（10個最豐富的菌屬之一）豐度較高，但剩余受試者中未檢測。歐洲和美國菌群研究中并沒有報告過Megamonas為腸道主要菌屬，但在一項中國菌群研究中有被報道，表明Megamonas可能是亞洲人群特征菌屬。各個階段CRC的基因組水平都顯著高于健康對照。主成分分析（PCA）篩選出所有受試者和251名健康對照中，兩個變化最大的菌：Bacteroides和Prevotella，兩者是人類腸道腸型的主要貢獻者（Fig.1b）。Dirichlet多項式混合模型將616個樣品分為四種群落類型，其中一個類型中Prevotella占主要部分。將風險因子（體重指數(shù)）、酒精消耗和吸煙史納入分析，四種群落類型之間不存在顯著差異。腸鏡檢查結(jié)果（健康，MP，S0，SI / II或SIII / IV）和腫瘤位置（左結(jié)腸，右結(jié)腸或直腸）與群落類型不存在相關性。年齡上呈現(xiàn)顯著差異分布，以及Prevotella菌群在男性中占主導地位（79.1％）。

代謝組學結(jié)果顯示，大腸中主要能源物質(zhì)丙酸鹽和丁酸鹽是含量最高的兩種代謝物。除了丙酸鹽和丁酸鹽，PCA結(jié)果顯示二氫尿嘧啶和尿素也存在較大差異（Fig.1b）。癌癥階段、腫瘤位置、性別與代謝物的變化都不存在相關性。

與健康對照相比，MP、S0、SI/II和SIII/IV樣品中的菌群均發(fā)生顯著改變。在S0、SI/II和SIII/IV組中，在門水平上，Firmicutes, Fusobacteria和Bacteroidetes升高，并隨著惡性程度的升高而升高。Fusobacteria菌種的升高至少出現(xiàn)在兩個階段，而Firmicutes和Bacteroidetes中許多菌種的升高都是階段特異性的。Proteobacteria門僅在MP階段升高（Fig.2a）。Bifidobacterium屬在S0中降低。本研究獲得了兩種顯著升高的菌種模式：第一種模式是早期到晚期一直升高，第二種模式僅在早期階段升高。第一種模式的特征菌是F. nucleatum (例如, F. nucleatum ssp. Nucleatum），Solobacterium moorei, Peptostreptococcus stomatis，Peptostreptococcus anaerobius, Lactobacillus sanfranciscensis，Parvimonas micra和Gemella morbillorum。第二種模式的特征菌是Atopobium parvulum, Actinomyces odontolyticus, Desulfovibrio longreachensis和Phascolarctobacterium succinatutens。通過實時定量PCR驗證了Atopobium parvulum豐度的變化。

本研究還確定了與CRC關聯(lián)的新物種，其中Colinsella aerofaciens，Dorealongicatena,Porphyromonas uenonis，Selenomonas sputigena和Streptococcus anginosus在SIII/IV中顯著升高。與之前的研究一致，Lachnospira multipara和Eubacterium eligens兩種產(chǎn)丁酸鹽菌顯著降低。產(chǎn)硫化物細菌Desulfovibrio vietnamensis，D. longreachensis和Bilophila wadsworthia降低。

此外， 研究還發(fā)現(xiàn)CRC不同階段中細菌復制率出現(xiàn)顯著變化，如G. morbillorum, P. micra和P. stomatis細菌復制率顯著升高。與健康對照相比， F. nucleatum ssp. nucleatum 和D. longicatena細菌復制率在SIII/IV中顯著升高。細菌復制率升高說明物種豐度相對較高，表明這些細菌可能具有代謝活性。值得注意的是S.moorei和C. aerofaciens分別在MP和S0中細菌復制率出現(xiàn)顯著升高。由此可見，許多菌種的改變可能與早期CRC發(fā)展有關。

與健康對照相比，有65種代謝物至少在一個階段呈現(xiàn)顯著差異，尤其是膽汁酸、短鏈脂肪酸、氨基酸和中心碳代謝與腸道菌群密切相關（圖2c）。與健康對照組相比，MP中DCA（脫氧膽酸鹽）濃度顯著升高；S0中甘氨膽酸鹽和?；悄懰猁}濃度顯著升高；支鏈氨基酸，苯丙氨酸，酪氨酸，甘氨酸，絲氨酸濃度也升高。異亮氨酸是由亮氨酸細菌發(fā)酵產(chǎn)生的支鏈脂肪酸，從S0到SIII / IV期濃度逐漸升高。由于MP中DCA升高，作者試圖找出與其相關的物種。B. wadsworthia是MP中唯一與DCA顯著相關的物種（圖2d）。在其他階段為不顯著正相關。已知B.wadsworthia在含有?；悄懰猁}的培養(yǎng)基中生長，?；悄懰猁}是DCA前體膽酸鹽的共軛形式。

鑒于Atopobium parvulum在MP和S0中顯著升高，已報道炎性腸病患者中Atopobium parvulum與鏈球菌的高度共存關系成為產(chǎn)硫化氫菌的網(wǎng)絡中心。分析結(jié)果顯示，在S0中，與Atopobium相關的細菌數(shù)量（屬和種水平）顯著升高（Fig.2e，f）。Atopobium parvulum 和 A. odontolyticus、S. anginosus、S. moorei、G. morbillorum之間存在很強的相關性，它們的相對豐度在S0和后續(xù)階段均升高。Atopobium在CRC早期階段的顯著升高表明，它可能對產(chǎn)硫化氫的菌群產(chǎn)生強烈影響。

與健康對照相比，基于KEGG數(shù)據(jù)庫篩選出1243個同源基因（KO基因）在至少一個階段顯著升高，96個KO基因在至少一個階段顯著降低。因為糞便氨基酸濃度從S0開始出現(xiàn)顯著變化（Fig.2c），通過分析菌群基因豐度以研究菌群在氨基酸代謝中的作用及菌群豐度變化（Fig.3a，3b）。

在差異最顯著的通路中，芳香族氨基酸代謝和產(chǎn)硫化物的通路與CRC相關。參與苯丙氨酸和酪氨酸合成的基因顯著升高，其中pheC被確定為區(qū)分S0患者和健康對照的得分最高標志物（Fig.4b）。在分解代謝通路中，參與苯丙氨酸降解的基因通過有毒苯乙酸鹽的產(chǎn)生而在MP中升高。參與色氨酸合成的基因在SIII / IV中顯著降低。負責產(chǎn)生基因毒性硫化氫的異化型亞硫酸鹽還原酶亞基A（dsrA）在SIII/IV中顯著升高（Fig.3b）。dsrA在許多硫酸鹽還原菌（如Desulfovibrio piger）中具有活性，而且這些菌群在SIII / IV中也很高。

大多數(shù)S0患者可以通過內(nèi)窺鏡方法治愈，而且被發(fā)現(xiàn)的機率很大。為了探討腸道宏基因組和代謝組學參數(shù)作為診斷標志物的潛力，通過構(gòu)建隨機森林和LASSO邏輯回歸模型來區(qū)分健康對照與S0和SIII/IV。僅基于菌種、KO基因、代謝物及三者組合構(gòu)建了四種模型。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)組合模型在S0和SIII / IV的分類上優(yōu)于單個模型（Fig.4b，c）。S0和SIII / IV 期CRC患者的隨機森林ROC面積分別達到0.78和0.85。

在S0分類中，特征值是KO基因，包括編碼環(huán)己二烯基脫水酶的pheC。其他特征值包括D.longreachensis，S.moorei，亮氨酸，纈氨酸，苯丙氨酸和琥珀酸（Fig.4b）呈現(xiàn)差異分布（Fig.2b，c）。在 SIII / IV分類中，特征值為口腔厭氧菌如P. micra, P. stomatis, F. nucleatum 和 P. anaerobius，之前已被確定為CRC的標志物（Fig.4b）。

對28名CRC患者（SI / II和SIII / IV）術前和術后1年的糞便樣品進行宏基因組測序。結(jié)果顯示，腫瘤切除后， P. stomatis, P. anaerobius, P. micra, P. uenonis 和 D. longicatena的相對豐度降低（Fig.4d，e）。與健康對照相比，HS（有結(jié)直腸手術史）患者的糞便樣本中這5個物種豐度無顯著差異（Fig.4f）。本研究得到的主要結(jié)果如Fig.4a所示。

本研究將有遺傳性或疑似遺傳性疾病的個體排除，以9組不同階段CRC（MP, S0, SI/II, SIII/IV, HS）病例作為研究對象，獲得了兩種升高的菌群模式，其中Atopobium parvulum和Actinomyces odontolyticus只在MP和/或S0階段顯著升高的第二種模式是本研究關注的重點，因為可能是腸道菌群狀態(tài)的改變使得個體易患CRC。Atopobium parvulum已被證明是產(chǎn)硫化氫菌的網(wǎng)絡樞紐，但需要進一步的研究來闡明這些細菌促成腫瘤發(fā)生的確切機制。在MP階段，DCA顯著升高，已報道DCA會導致DNA損傷和突變升高。動物研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸會導致腸道中腫瘤發(fā)生率升高。B.wadsworthia的生長受膽汁的刺激，是本研究中唯一與DCA顯著相關的物種。已報道B.wadsworthia會引起炎癥，但B.wadsworthia與癌癥發(fā)生相關的研究未見報道。本研究獲得了S0階段的宏基因組學和代謝組學標志物，并且從CRC發(fā)展的早期階段就發(fā)現(xiàn)了宏基因組組和代謝組的變化，這具有病原學和診斷意義。雖然尚不清楚這些腸道菌群和代謝物是否直接導致腫瘤發(fā)生，但腸道菌群的結(jié)構(gòu)性變化可能導致致癌微環(huán)境的變化。由此可見，CRC不僅是一種遺傳疾病，也是一種菌群疾病。