影響因子：14.299      PMID：31239244     期刊年卷：Ann. Rheum. Dis. 2019 Jun 25;

導語：

1：過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPARγ）的軟骨抑制和骨關節(jié)炎（OA）易感基因的異常表觀遺傳修飾對OA發(fā)展有顯著貢獻; 然而，潛在的機制仍不清楚。

2：我們證明由內側半月板失穩(wěn)術引起的人和小鼠OA軟骨中的PPARγ抑制基本上由異常的DNA甲基轉移酶DNMT1 / DNMT3a增加和相關的PPARγ啟動子高甲基化引起。此外，DNMT1 / DNMT3a的藥理學抑制可以有效地使PPARγ啟動子去甲基化，減少PPARγ抑制和減輕PPARγ依賴性地OA小鼠的軟骨損傷。

3：通過DNA去甲基化使PPARγ不被抑制在治療OA和相關關節(jié)疾病方面具有治療潛力。

主要實驗結果：

1：PPARγ在OA患者和DMM小鼠的關節(jié)軟骨中受到抑制

圖1：（A）經過假手術或DMM手術操作10周的PPARγWT對照和的PPARγKO小鼠的膝關節(jié)番紅-O /快速綠色染色切片的代表照片。箭頭表示受損的軟骨。（B）通過對圖1A中小鼠的OARSI評分來定量OA嚴重程度。（C）來自圖1A每組小鼠的兩個隨機選擇的樣品的膝關節(jié)軟骨的PPARγ蛋白的Western分析。（D）Sham和DMM小鼠的膝關節(jié)切片的PPARγ的代表性IHC染色。箭頭指向陽性染色的軟骨細胞。（E）三個OA患者和四個正常對照的軟骨的MMP13，Aamts5，Aggrecan和PPARγ的Western分析。（F）OA患者和對照的軟骨PPARγ的IHC染色。箭頭指向陽性染色的軟骨細胞。

 2：DNMT1和DNMT3a升高引起PPARγ啟動子DNA高甲基化從而抑制PPARγ表達

圖2：（A）三個骨關節(jié)炎（OA）患者和四個對照的人的軟骨以及假手術和內側半月板失穩(wěn)手術的小鼠的DNA甲基轉移酶（DNMT）DNMT1，DNMT3a和DNMT3b的蛋白質印跡分析。（B）Sham或DMM小鼠的DNMT1，DNMT3a和DNMT3b的軟骨免疫組織化學染色。箭頭指示陽性染色的軟骨細胞。（C）人和小鼠PPARγ啟動子的示意圖。相對于轉錄起始位點，描繪了CpG島（灰色區(qū)域）和甲基化特異性PCR（MSP）/亞硫酸氫鹽測序PCR（BSP）引物的位置。同時顯示了鳥嘌呤和胞嘧啶（GC）含量。（D）細胞MSP分析。用瓊脂糖凝膠電泳分析用IL-1β（10ng / mL）和/或5Aza（10μM）處理24小時的培養(yǎng)的人SW1353軟骨細胞（左圖）和小鼠原代軟骨細胞（右圖）的代表性MSP產物。（E）正常對照和OA患者以及Sham，5Aza處理，DMM和5Aza處理的DMM小鼠的軟骨MSP分析。（F）Sham，5Aza處理，DMM和5Aza處理的DMM小鼠的軟骨BSP分析。將每組三只隨機選擇的小鼠（M1，M2和M3）進行BSP分析。將PCR產物克隆到質粒中，對每只動物的5個克隆進行測序。一個盒子代表一只老鼠。方框中的每行點代表一個單一的測序克隆，每個點代表一個CpG位點。空點或暗點分別表示未甲基化或甲基化的CpG。

3：5Aza能解除PPARγ的抑制并預防小鼠的OA發(fā)病機制

圖3： C57BL/6小鼠分成Sham，5Aza處理（每天0.35mg / kg腹膜內注射），內側半月板失穩(wěn)（DMM）和5Aza處理的DMM組處理10周和15周。（A）番紅O /快速綠色（上圖和中圖）或番紅O /蘇木精（下圖）染色的膝關節(jié)切片照片。箭頭表示受損的軟骨（紅色），內側半月板附近發(fā)炎的滑膜（深色）或增厚軟骨下骨板（SBP，黃色）。中間面板的圖像是上面板的方格區(qū)域。（B）骨關節(jié)炎參數的定量。軟骨損傷，滑膜炎評分和SBP厚度的OARSI評分。（C）Sham，DMM和5Aza處理的小鼠關節(jié)組織的PPARγ，MMP13，Aamts5，Aggrecan和Collagen2的Western印跡分析（10周）。（D）C圖的定量。

4：5Aza阻止了IL-1β誘導的PPARγ抑制和減少軟骨細胞中PPARγ依賴性地OA的相關蛋白的表達

圖4：（A）在各種劑量（0,1,5和10μM）的5Aza下，用IL-1β（10ng / mL）處理24小時的小鼠軟骨細胞的PPARγ的Western印跡圖。量化在圖的下方，數據表示為基于三個獨立實驗的平均值±SD。（B）用IL-1β（10ng / mL）或/和5Aza（10μM）處理24小時的小鼠軟骨細胞中PPARγ，MMP13，ADAMTS5和Collagen2的Western印跡或（C）在有或沒有特異性PPARγ抑制劑T0070907（Pi，10μM）的情況下的各個蛋白的western印跡圖。（D）C圖的定量。

5：5Aza使得PPARγ的恢復可平衡IL-1β引起的氧化應激和軟骨細胞過度炎癥

圖5：（A）來自骨關節(jié)炎（OA）患者和對照的以及假手術和內側半月板失穩(wěn)（DMM）小鼠（10周）的軟骨SOD2和過氧化氫酶的Western印跡。（B）Sham，DMM和5Aza / DMM小鼠的軟骨SOD2和過氧化氫酶的Western印跡（10周）。（C）圖5B的定量。數據表示為平均值±SEM。（D）細胞內氧化劑測定。用含有或不含有IL-1β（10ng / mL）的5Aza（10μM）處理SW1353細胞24小時。測量細胞內超氧化物水平并用熒光顯微鏡獲得圖像。（E）在存在或不存在Pi（10μM）的情況下用IL-1β（10ng / mL）和5Aza（10μM）處理小鼠原代軟骨細胞24小時的過氧化氫酶和SOD2的蛋白質印跡。（F）圖5E的量化?；谌齻€獨立實驗，數據表示為平均值±SD。（G）定量實時PCR（qRT-PCR）測定。在不存在T0070907（Pi，10μM）的情況下，用5Az（10μM）或IL-1β（10ng / mL）處理原代小鼠軟骨細胞24小時。通過qRT-PCR分析細胞裂解物的IL-1β和TNF-αmRNA?；谌齻€獨立實驗，值表示為平均值±SD。

6：在體內5Aza 在PPARγ對于軟骨保護的作用中至關重要

圖6：（A）番紅O /快速綠色染色的膝關節(jié)切片的代表性顯微照片。箭頭表示受損的軟骨。下面板是上面板關節(jié)軟骨的方框區(qū)域。（B）通過OARSI評分定量軟骨損傷。（C）小鼠關節(jié)組織的Aamts5，MMP13，Aggrecan和Collagen2蛋白的Western印跡圖。（D）圖6C的量化。（E）小鼠關節(jié)組織的PPARγ，SOD2和過氧化氫酶表達蛋白質印跡圖。（F）圖6E的定量。（G）對小鼠關節(jié)組織IL-1β和TNF-α的mRNA水平的定量實時PCR分析。對于（C）和（E）中的蛋白質印跡，僅顯示來自每組的兩個隨機選擇的樣品。所有定量（B，D，F和G）表示為所有動物樣品的平均值±SEM; N = 6。

原文摘要：

Objectives Osteoarthritis (OA) is the most common degenerative joint disease in aged population and its development is significantly influenced by aberrant epigenetic modifications of numerous OA susceptible genes; however, the precise mechanisms that DNA methylation alterations affect OA pathogenesis remain undefined. This study investigates the critical role of epigenetic PPARγ (peroxisome proliferator–activated receptor-gamma) suppression in OA development.

Methods Articular cartilage expressions of PPARγ and bioactive DNA methyltransferases (DNMTs) from OA patients and mice incurred by DMM (destabilisation of medial meniscus) were examined. DNA methylation status of both human and mouse PPARγ promoters were assessed by methylated specific PCR and/or bisulfite-sequencing PCR. OA protections by a pharmacological DNA demethylating agent 5Aza (5-Aza-2'-deoxycytidine) were compared between wild type and PPARγ knockout mice.

Results Articular cartilages from both OA patients and DMM mice display substantial PPARγ suppressions likely due to aberrant elevations of DNMT1 and DNMT3a and consequential PPARγ promoter hypermethylation. 5Aza known to inhibit both DNMT1 and DNMT3a reversed the PPARγ promoter hypermethylation, recovered the PPARγ loss and effectively attenuated the cartilage damage in OA mice. 5Aza also inhibited the OA-associated excessive inflammatory cytokines and deficit anti-oxidant enzymes, which were blocked by a specific PPARγ inhibitor in cultured chondrocytes. Further, 5Aza-confered protections against the cartilage damage and the associated abnormalities of OA-susceptible factors were significantly abrogated in PPARγ knockout mice.

Conclusion  Epigenetic PPARγ suppression plays a key role in OA development and PPARγ preservation via promoter demethylation possesses promising therapeutic potentials in clinical treatment of OA and the related joint diseases.