我國歷次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，非結(jié)核分枝桿菌（NTM）分離率從1990年的4.9%升至2000年的11.1%，2010年為22.9%，NTM的分離率持續(xù)增高，這基本反映出我國NTM病呈明顯上升的態(tài)勢，并已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題。NTM鑒別診斷較為困難，臨床上NTM肺病與肺結(jié)核在癥狀、體征及影像學(xué)表現(xiàn)方面均具有很大的相似性，但無論從病原學(xué)還是治療上，都與肺結(jié)核有一定的區(qū)別。NTM肺病無法通過痰分枝桿菌抗酸染色進行鑒別，要明確病原學(xué)診斷須進行菌種鑒定，而采用經(jīng)典的痰培養(yǎng)及菌種鑒定方法需要8周左右的時間。在臨床工作中，很多肺部疾病患者最初診斷為“肺結(jié)核”，但數(shù)周過后，菌種鑒定報告卻提示為NTM生長，且對幾乎所有的一線抗結(jié)核藥物均耐藥，因而不得不調(diào)整或更換所有的治療方案。

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非結(jié)核分枝桿菌（NTM）指除MTB復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的一大類分枝桿菌總稱，是一種環(huán)境生長菌，在自然界廣泛存在，目前全世界已發(fā)現(xiàn)NTM約154種，但只要少數(shù)是致病菌，屬于條件致病菌，主要侵犯肺部，近年來國內(nèi)NTM病發(fā)病率不斷增加，以鳥復(fù)合分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和蟾蜍分枝桿菌最為常見。從對臨床指導(dǎo)意義考慮，將NTM簡單分為快生長分枝桿菌（RGM）和慢生長分枝桿菌（SGM），即可對用藥選擇提供有益信息。臨床最常見的有臨床價值的RGM包括膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌和龜分枝桿菌，RGM感染通常選用大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類等藥物治療。最常見的有臨床價值的SGM包括鳥分枝桿菌復(fù)合群（MAC，主要包括鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌）、堪薩斯分枝桿菌及蟾蜍分枝桿菌等，治療通常選取大環(huán)內(nèi)酯類和利福霉素類藥物，有時候加用注射類抗結(jié)核藥物。

由于各大醫(yī)院對于非結(jié)核分枝桿菌的診斷水平和標(biāo)準(zhǔn)參差不齊，誤診率較高，為促進實驗室NTM檢驗水平的提高，同時提高臨床醫(yī)生對實驗室結(jié)果的正確認知，中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會組織流行病、臨床和實驗室領(lǐng)域?qū)＜揖蚇TM相關(guān)實驗室診斷領(lǐng)域的重要問題進行討論，2016年撰寫了最新的《非結(jié)核分枝桿菌病實驗室診斷專家共識》。

中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會.《非結(jié)核分枝桿菌病實驗室診斷專家共識》

文中指出，傳統(tǒng)的根據(jù)生化和鑒別培養(yǎng)基進行菌種鑒定的方法不但耗時，而且不能完全將許多NTM菌種鑒定出來，因此已不常用。

現(xiàn)階段常用的臨床菌種鑒定方法有以下幾種：

1. 對硝基苯甲酸（PNB）選擇性培養(yǎng)基法

此方法在我國廣泛開展，NTM可在含500 mg/L PNB的羅氏培養(yǎng)基上生長，而MTC不耐受，較多結(jié)果表明此方法可用于鑒定MTC和NTM。

2. MPT64抗原檢測法

MPT64抗原是MTC在液體培養(yǎng)基中生長時主要分泌的蛋白之一，NTM培養(yǎng)濾液中多不存在此分泌蛋白，由此可以進行初步菌種鑒定。檢測方法大多采用免疫層析法檢測培養(yǎng)濾液中MPT4抗原是否存在，具有操作簡單、用時短等優(yōu)點。此技術(shù)具有很高的敏感度（多數(shù)報道超過97%）和特異度（多數(shù)報道超過97%）。

3. 核酸擴增實驗

PCR技術(shù)，結(jié)核病診斷的PCR試劑盒擴增的靶序列往往是MTC中特異性的DNA序列，如IS6110、MPT64、ESAT-6及CFP-10等。將PCR技術(shù)與涂片和培養(yǎng)結(jié)合可用于NTM的初步篩查。對于涂片陽性或是培養(yǎng)陽性的標(biāo)本，平行的PCR擴增獲得陽性結(jié)果提示樣品中存在MTC菌，反之，當(dāng)PCR為陰性結(jié)果時，應(yīng)考慮存在NTM的可能，但需要進一步核實。

4. 分子診斷技術(shù)

同源基因或序列比較，通過分析同源DNA序列組成差異鑒定細菌至種水平，可用于菌種鑒定的DNA序列既要求在不同的菌種間具有較高的序列保守性，實現(xiàn)應(yīng)用通用引物對不同菌種目標(biāo)序列的擴增，又要求不同菌種的同源序列具有一定水平的差異，以實現(xiàn)鑒別區(qū)分的目的。目前最常用的同源序列有16S RNA編碼基因（16S DNA）、16S-23S rRNA基因間區(qū)（ITS）、RNA聚合酶的β-亞基（rpoB）和熱休克蛋白65(hsp65)的編碼基因。

5. 依據(jù)細菌結(jié)構(gòu)差異進行菌種鑒定

高效液相分析細胞壁的分枝菌酸碳鏈結(jié)構(gòu)和蛋白成分在菌體中的比例。細菌的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的組成具有種屬特異性，這2種方法均已經(jīng)建立了包含豐富菌種的圖譜庫用于結(jié)果比對，因此具有很高的鑒別能力。

以上方法均用于臨床分離株的鑒定，因此不利于臨床的及時診斷，在我國NTM分離率不斷提高情況下，迫于各種不利因素，急切需要一種方法利于快速、省時、方便、可信度高的方法用于菌種鑒定。

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1. 藥敏性實驗

雖然美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）對于一些NTM菌種有推薦的藥敏試驗方法和藥物臨界濃度，但這些方法仍有待臨床充分地評價和調(diào)整。開展沒有推薦方法的菌種的藥敏試驗時，常規(guī)做法是慢生長分枝桿菌多參照MTB選取臨界藥物濃度，而快生長分枝桿菌多參照普通細菌選取臨界藥物濃度。但不同種的分枝桿菌的耐藥臨界濃度可能存在明顯差異，因此需要開展更多的臨床和基礎(chǔ)研究，以建立針對不同菌種的藥敏試驗方法。從目前已獲得的數(shù)據(jù)來看，NTM感染的治療效果主要取決于菌種，如堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌的療效較好，而MAC、膿腫、龜分枝桿菌的治療療效較差，表明種屬對藥物的敏感性至關(guān)重要。只有同一菌種不同菌株對藥物的敏感性存在分化時，才有必要開展藥敏試驗。

2. 耐藥性分子診斷

NTM和MTC有相同或類似的藥物靶位，但NTM對很多抗結(jié)核藥物天然耐藥，表明NTM細胞壁通透性、藥物外排泵、藥物與靶位的低親和力等其他因素較基因多態(tài)性在NTM耐藥中發(fā)揮著更為重要的作用。臨床上對于結(jié)核分枝桿菌的分子檢測是比較明確的，但非結(jié)核分枝桿菌現(xiàn)在只有個別的一些菌株我們能檢測到，如MAC耐大環(huán)內(nèi)酯類藥物與23S核糖體RNA基因（rrl）的基因突變高度相關(guān)；16S核糖體RNA基因（ITS）突變與膿腫分枝桿菌、龜分枝桿菌對阿米卡星耐藥相關(guān)；rpoB基因突變與堪薩斯對利福平耐藥相關(guān)。有限的研究結(jié)果提示，一些已知基因的單核苷酸多態(tài)性可能與耐藥有關(guān)，但現(xiàn)有的數(shù)據(jù)僅報道了個別藥物中較低比例的耐藥菌株可能與某一基因的序列多態(tài)性有關(guān)，因此，未來耐藥分子機制方面有待更深入的研究，才有助于未來應(yīng)用分子手段盡快發(fā)現(xiàn)耐藥菌株。

隨著二代測序（NGS）、三代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，宏基因組測序發(fā)生了巨大變化，在獲得海量數(shù)據(jù)后，能夠快速、全面的分析病原體群落結(jié)構(gòu)。

宏基因組學(xué)是以某一特定環(huán)境樣品中的病原體基因組為研究對象，以測序分析的手段，以病原體多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的病原體研究方法。宏基因組測序直接從樣品中提取基因組DNA后測序分析，將所測序列與專業(yè)數(shù)據(jù)庫對比，得出樣本中所含物種信息：通過嚴(yán)格的宏基因組拼接，獲得較長的DNA片段；若測序達到一定的通量可獲得一個或多個病原體基因組草圖；在此基礎(chǔ)上進行功能分析及病原體群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析。

目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)、食品安全、醫(yī)學(xué)研究及臨床診斷等領(lǐng)域，在臨床上的應(yīng)用如感染類型診斷、耐藥和敏感分析、傳染病的防控等。該方法的應(yīng)用在臨床上對病原體檢測、預(yù)測對藥物敏感性方面已經(jīng)取得了進展。

隨著科學(xué)的進步與醫(yī)療的發(fā)展，我國結(jié)核病疫情逐步得到控制，而我國的非結(jié)核分枝桿菌感染問題卻越來越突出，臨床對NTM感染疾病的診斷和治療問題急需解決。宏基因組測序方法避開了傳統(tǒng)方法病原體培養(yǎng)、分離的局限性，直接分析樣本中病原體，更好地解決目前結(jié)核和非結(jié)核鑒定困難、診斷時間周期長等問題。目前為止，基因測序是最精準(zhǔn)的鑒定NTM菌種的方法，并且測序只需要極少的菌。

將宏基因組測序技術(shù)應(yīng)用于臨床檢測NTM，對于臨床醫(yī)生將解決了一個棘手的問題，該方法輔助臨床診斷以及對藥物治療提供了可靠依據(jù)，通過16sRNA測序檢測高度保守的16s核糖體亞基，準(zhǔn)確鑒定、分析樣品中的病原體是否含有NTM，同時對測序病原體耐藥性進行預(yù)測，通過與耐藥相關(guān)基因進行比對，確定耐藥基因是否發(fā)生基因突變來完成病原體對藥物耐藥性的預(yù)測。宏基因組測序技術(shù)應(yīng)用于NTM檢測及耐藥分析，可較容易地在短時間內(nèi)區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，減少了誤診幾率、診斷時間，并且根據(jù)藥敏性分析更好地確定藥物，避免了耐藥性帶來的錯誤用藥問題。

參考文獻：

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