image.png 研究背景每個細(xì)胞組分的生物學(xué)功能都是由如“俄羅斯套娃”樣的多級基因調(diào)控層次控制的，包括轉(zhuǎn)錄因子-啟動子互作、增強(qiáng)子激活、DNA甲基化、microRNA介導(dǎo)的調(diào)控、翻譯和翻譯后修飾。在癌細(xì)胞中，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)常常被共同導(dǎo)致癌癥表型的分子畸變重構(gòu)。例如，體細(xì)胞突變可以修飾調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中反式和順式元件的功能，從而賦予與腫瘤發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞行為。大型患者隊列TCGA研究系統(tǒng)地表征了各種癌癥類型的不同水平的關(guān)鍵分子改變，為致癌機(jī)制和潛在治療方法提供了前所未有的見解。 增強(qiáng)子活化過程 注：CAGE-seq（cap analysis of gene expression），結(jié)合mRNA加帽位點(diǎn)鑒定和高通量測序的手段，可以高通量地鑒定整個細(xì)胞內(nèi)mRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，從而獲得準(zhǔn)確的啟動子信息和5’UTR信息。 研究目的（1）描述癌癥中增強(qiáng)子表達(dá)的全局模式； 研究路線路線 研究結(jié)果增強(qiáng)子篩選及表達(dá)分析流程 1.人類癌癥中增強(qiáng)子表達(dá)概況來自33種癌癥的8,928個癌癥樣本TCGA RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)，共計鑒定到15,808個增強(qiáng)子。每種癌癥類型>10％樣本平均檢測到4,591種增強(qiáng)子。在25種具有足夠樣本量以及隨訪時間的癌癥類型中，通過Cox回歸分析與疾病生存期相關(guān)的活性增強(qiáng)子，結(jié)果表明許多活性表達(dá)的增強(qiáng)子與預(yù)后相關(guān)。肝臟肝細(xì)胞癌（LIHC）具有最低的增強(qiáng)子表達(dá)水平（?100RPM），而胸腺瘤（THYM）增強(qiáng)子表達(dá)水平最高（?240RPM）。與相同患者的正常組織相比，大多數(shù)癌癥類型的腫瘤組織的增強(qiáng)子表達(dá)水平升高，即增強(qiáng)子活化。 不同癌癥中表達(dá)的活性增強(qiáng)子及與預(yù)后相關(guān)的活性增強(qiáng)子 不同癌癥活性增強(qiáng)子的表達(dá)水平以及與正常對照樣本間的比較 2. 腫瘤中增強(qiáng)子活化與腫瘤非整倍性（aneuploidy）正相關(guān)體細(xì)胞拷貝數(shù)改變（Somatic copy-number alteration, SCNA）和點(diǎn)突變是2種影響癌癥基因組穩(wěn)定性的最常見的突變。結(jié)合來自Affymetrix SNP6.0的非整倍體數(shù)據(jù)（SCNA）以及全外顯子組測序得到沉默（silent）體細(xì)胞突變（不引起氨基酸替換）數(shù)據(jù)（TMB，突變負(fù)荷/載量），與增強(qiáng)子活化數(shù)據(jù)（RPM）聯(lián)合分析，表明大多數(shù)癌癥類型（19/25）中非整倍體水平與增強(qiáng)子活化水平呈顯著正相關(guān)。相反，沉默點(diǎn)突變則沒有相關(guān)性或只有輕微的負(fù)相關(guān)性。 SCNA / silent TMB vs. 增強(qiáng)子表達(dá)水平RPM 注：橙色或藍(lán)色表示相關(guān)系數(shù)Spearman’s correlation coefficient (rho)檢驗為顯著的。 對腫瘤樣本的1500個增強(qiáng)子表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行consensus聚類分析，得到3種亞類（簇）：C1、C2和C3，并且不受疾病類型驅(qū)動。3種亞類的腫瘤樣本增強(qiáng)子表達(dá)水平均高于其正常樣本，其中C2亞類的增強(qiáng)子表達(dá)水平最高。如前所述，SCNA與增強(qiáng)子表達(dá)水平正相關(guān)，故而C2亞類中受SCNA的影響比較大，SCNA影響數(shù)千基因表達(dá)。對于silent體細(xì)胞突變負(fù)荷TMB，C1>C2>C3。增強(qiáng)子激活與基因組不穩(wěn)定性的相關(guān)性可以概括為下圖：C1亞類富含具有高突變負(fù)荷和低非整倍性的樣品；C2亞類富含具有較高突變負(fù)荷和高非整倍性的樣品；C3為“normallike”，接近于正常組織，具有低突變負(fù)荷和低非整倍性。癌癥類型內(nèi)和癌癥類型間的分析都表明SCNAs是與增強(qiáng)子激活正相關(guān)的突變形式，而不是silent點(diǎn)突變。 根據(jù)增強(qiáng)子表達(dá)數(shù)據(jù)對腫瘤樣本進(jìn)行consensus聚類分析 不同亞類間的增強(qiáng)子表達(dá)水平、SCNA和silent突變負(fù)荷比較 3. 以“染色質(zhì)狀態(tài)”為中心的增強(qiáng)子激活、SCNAs和點(diǎn)突變的互作模型為什么SCNAs和點(diǎn)突變與癌癥中的增強(qiáng)子激活相關(guān)聯(lián)？據(jù)報道，人類基因組染色質(zhì)空間組織的變化是整個基因組體細(xì)胞突變率變化的主要決定因素。低突變率是開放染色質(zhì)DNA的一個特征，因為突變可通過DNA修復(fù)機(jī)制獲得修復(fù)；同時，染色質(zhì)開放恰好是增強(qiáng)子活化的先決條件。激活后，增強(qiáng)子與目標(biāo)DNA成環(huán)，并與其互作，產(chǎn)生DNA-DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上的互作；當(dāng)發(fā)生斷裂時，遠(yuǎn)程DNA-DNA物理上接觸增加了部分1D-序列相距很遠(yuǎn)的位點(diǎn)接觸和發(fā)生重排的機(jī)率，由此產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變異——這揭示了SCNAs和點(diǎn)突變分別與增強(qiáng)子激活間差異相關(guān)性的分子機(jī)制，是建立在染色質(zhì)開放性差異的基礎(chǔ)上。在該模型中，緊湊染色質(zhì)有利于點(diǎn)突變并保持增強(qiáng)子沉默；一旦染色質(zhì)打開，增強(qiáng)子被激活的可能性增加。同時，由于展開的DNA被拉長了1-2個數(shù)量級，所以遠(yuǎn)程DNA-DNA互作發(fā)生的可能性增加，同時增加了DNA重排（SCNA）的機(jī)會。ATAC-seq和H3K27ac的ChIP-seq數(shù)據(jù)標(biāo)識開放染色質(zhì)（open chromatin），用H3K9me2和H3K9me3標(biāo)識封閉染色質(zhì)（closed chromatin），開放和封閉染色質(zhì)的雙鏈斷裂（DSB，SCNA斷裂點(diǎn)）率和點(diǎn)突變率的確呈現(xiàn)相反趨勢。 以“染色質(zhì)狀態(tài)”為中心的模型 根據(jù)上述模型，開放染色質(zhì)中的遠(yuǎn)程DNA-DNA互作（Hi-C互作），至少在一定程度上解釋了增強(qiáng)子激活和不同基因組區(qū)域中SCNAs的正相關(guān)性。為了測試這種可能性，作者檢測了人基因組的雙鏈斷裂（DSB）率最高的500個10-kb片段，發(fā)現(xiàn)40％（n = 204）富集于Hi-C鑒定到的Loop區(qū)域。同時，增強(qiáng)子也傾向與loop區(qū)域重疊。下圖提供了一個簡單而合理的假設(shè)模型，雖然僅試驗性地解釋了增強(qiáng)子激活與SCNAs和突變的差異關(guān)聯(lián)。 開放染色質(zhì)促進(jìn)DNA結(jié)構(gòu)重排的假設(shè)模型 4. 系統(tǒng)性鑒定與癌癥基因互作的具有因果關(guān)系的增強(qiáng)子整合增強(qiáng)子和mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，通過共表達(dá)分析可獲得增強(qiáng)子的候選靶基因。對于共表達(dá)的特定增強(qiáng)子-基因組合，至少存在3種可能的關(guān)系模型：（1）因果關(guān)系，增強(qiáng)子表達(dá)的變化引起基因的差異表達(dá)；（2）reactive關(guān)系，基因位于增強(qiáng)子的上游；（3）共響應(yīng)關(guān)系，增強(qiáng)子和基因都響應(yīng)其它分子變化。本文中以第一種關(guān)系進(jìn)行探討，引入eQTL進(jìn)行分析?；驹砣缦拢河绊懺鰪?qiáng)子活性的單核苷酸多態(tài)性（SNP）會影響增強(qiáng)子下游靶基因的表達(dá)，由此使得SNP（或鄰近連鎖遺傳的SNP）成為目標(biāo)基因的eQTL位點(diǎn)；對于這樣的共表達(dá)增強(qiáng)子-基因?qū)?，使用Hi-C數(shù)據(jù)來評估該因果關(guān)系是否為直接調(diào)控。
共表達(dá)增強(qiáng)子與基因之間的關(guān)系模型以及鑒定具有因果關(guān)系的增強(qiáng)子-基因互作的流程 根據(jù)該方法，鑒定了65個符合條件的互作，涉及49個增強(qiáng)子和47個癌癥基因，并繪制了預(yù)測的增強(qiáng)子-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中22個和8個癌癥基因分別注釋為CGC數(shù)據(jù)庫中的癌基因（oncogene）和腫瘤抑制基因（TSG），表明增強(qiáng)子更傾向于調(diào)控癌基因。根據(jù)CGC注釋，這30個基因位于不同的癌癥hallmarks基因集中，富集于增殖和轉(zhuǎn)移。這些增強(qiáng)子-基因共表達(dá)富集于直接調(diào)控和因果調(diào)控?？傊?，這些結(jié)果提供了增強(qiáng)子激活可能有助于腫瘤發(fā)展的途徑的見解。
增強(qiáng)子-基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò) 5. 靶向臨床上可操作基因的增強(qiáng)子具有潛在的臨床相關(guān)性增強(qiáng)子作為預(yù)后標(biāo)志物：作者以chr22（chr22：50980817-50981280，下文簡稱增強(qiáng)子22）和其推斷的目標(biāo)基因SYK為例，詳細(xì)分析了增強(qiáng)子如何調(diào)控驅(qū)動基因從而作為預(yù)后標(biāo)志物。ENCODE ChIP-seq數(shù)據(jù)集注釋到增強(qiáng)子22區(qū)域內(nèi)或其側(cè)翼富集大量蛋白質(zhì)-DNA互作peak。3個連鎖遺傳的SNP位于增強(qiáng)子22中，這3個SNP都是SYK基因的eQTL（基因型與mRNA或者蛋白表達(dá)水平相關(guān)）。SYK是一種致癌驅(qū)動基因，在多種類型的晚期癌癥中被激活，并且與臨床預(yù)后不良相關(guān)?；颊呱鏁r間分析進(jìn)一步支持了增強(qiáng)子22作為幾種癌癥類型的不良預(yù)后的標(biāo)志物。由于eQTL、RNA-seq和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)是從獨(dú)立平臺生成的，并且在多個來源組織中觀察到相關(guān)性，所以這些結(jié)果提供了增強(qiáng)子22是預(yù)后標(biāo)志物的證據(jù)，主要通過對其下游基因SYK的調(diào)控作用實(shí)現(xiàn)。
不同癌癥中增強(qiáng)子22的K-M生存曲線分析 增強(qiáng)子作為免疫治療反應(yīng)的預(yù)測標(biāo)志物：PD-L1在癌癥免于免疫系統(tǒng)攻擊中扮演著重要角色，因此一直是免疫治療“檢查點(diǎn)抑制”的主要靶標(biāo)，尤其是肺癌和黑色素瘤的治療，下面以距PD-L1約140kb的增強(qiáng)子（chr9：5580709-5581016，下文稱為增強(qiáng)子9）為例進(jìn)行闡述。作者發(fā)現(xiàn)多種癌癥類型中觀察到PD-L1 mRNA和增強(qiáng)子9之間的強(qiáng)共表達(dá)；在CCLE（癌癥細(xì)胞系百科全書數(shù)據(jù)庫）130個肺癌細(xì)胞系中也證實(shí)了增強(qiáng)子9與PD-L1共表達(dá)；PD-L1 eQTL位于增強(qiáng)子的鄰近區(qū)域，表明增強(qiáng)子是PD-L1的上游調(diào)控元件；人類細(xì)胞系的Hi-C數(shù)據(jù)集進(jìn)一步證實(shí)了PD-L1基因和增強(qiáng)子9之間的直接相互作用。ENCODE項目中調(diào)查的161個轉(zhuǎn)錄因子中，NF-kB是唯一注釋到增強(qiáng)子9的一個轉(zhuǎn)錄因子；ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示NF-kB強(qiáng)烈結(jié)合在增強(qiáng)子9上以及PD-L1啟動子的p65結(jié)合基序上，表明NF-kB參與增強(qiáng)子/ PD-L1相互作用。同時，最近有研究報道，NF-kB二聚體對于PD-L1的激活是必不可少的。利用CRISPR-Cas9敲除增強(qiáng)子9，獲得穩(wěn)定的增強(qiáng)子9純合缺失的肺癌A549細(xì)胞系。增強(qiáng)子9的敲除在mRNA和蛋白質(zhì)水平都顯著降低PDL1表達(dá)，掩蓋了IFN-g（活化的NF-kB）誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)的效應(yīng)。這些結(jié)果表明，NF-kB介導(dǎo)的增強(qiáng)子-啟動子相互作用的PD-L1活化模型，強(qiáng)調(diào)了增強(qiáng)子調(diào)節(jié)關(guān)鍵治療靶點(diǎn)的潛在重要方式。
增強(qiáng)子9調(diào)控免疫治療靶點(diǎn)PD-L1表達(dá) |
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