AAV載體是目前基因治療研究中常用的載體之一。Asklepios BioPharmaceutical（AskBio）是一家專注于AAV基因療法開發(fā)的公司，擁有豐富的AAV衣殼庫和規(guī)?；疨ro10生產(chǎn)工藝，其正在推進AAV基因療法在臨床上的應用。

致力于開發(fā)基因療法的AskBio

Asklepios BioPharmaceutical（AskBio）

Asklepios BioPharmaceutical（AskBio）的命名源自希臘神話中的天醫(yī)—Asclepius，他治愈了許多不治之癥，被視為醫(yī)學之神。

秉承著治療難治性疾病的宗旨，AskBio致力于AAV基因療法的開發(fā)，為臨床上治療血友病、杜氏肌營養(yǎng)不良癥及巨軸神經(jīng)病變（GAN）等難治性遺傳病提供新的治療選擇。

AskBio的聯(lián)合創(chuàng)始人—Richard Jude Samulski

AskBio成立于2001年，其聯(lián)合創(chuàng)始人之一是Dr. Richard Jude Samulski，是第一位克隆出AAV基因組并將其用于治療目的科學家。

Dr. Samulski深耕AAV領域長達40年之久，AskBio的成立得益于他在北卡羅萊納大學教堂山分校對AAV作為基因療法載體的研究。Dr. Samulski的研究推進了AAV基因療法在臨床上的應用。

AskBio的Capsid&vector技術

AAV是一種無包膜DNA病毒，外包衣殼蛋白，根據(jù)衣殼蛋白抗原的不同，AAV可以分為多個血清型，不同血清型的AAV具有不同的組織細胞靶向性。

AAV的基因組為單鏈線狀DNA（single strand DNA, ssDNA），兩末端為反向末端重復序列（ITR），是AAV復制和包裝所必需的作用元件。在ITR之間為Rep和Cap基因，編碼病毒的衣殼蛋白。

臨床上應用的AAV治療載體僅保留了AAV的ITR，而將Rep和Cap基因以目的基因表達框替代。

AskBio的AAV技術可以對病毒的衣殼蛋白（Capsid）或基因組（vector）進行改造，設計構建針對特定疾病的新型AAV載體，為臨床上治愈或減輕難治性疾病的癥狀提供可能。

雙鏈AAV載體（Self-Complementary Vectors）

AAV感染細胞后，其ssDNA不能直接作為轉錄的模板，需要進一步合成雙鏈DNA，才能實現(xiàn)目的基因的表達。該步驟通常被認為是AAV介導外源基因表達的主要限速步驟。

Dr. Samulski等通過基因工程手段，對AAV病毒的基因組進行了改造，得到了雙鏈AAV載體（也稱自身互補載體，self complementary vectors）。該類AAV載體感染細胞后可以立即轉錄，因此能夠有效地解決速率限制的問題。

針對該技術，2001年5月31日北卡羅萊納大學教堂山分校遞交了涉及雙鏈細小病毒載體的國際申請PCT/US2001/017587。

PCT/US2001/017587對應的美國專利US7465583B2涉及一種向哺乳動物施用核酸的方法，包括使哺乳動物細胞與細小病毒顆粒接觸。該細小病毒載體的基因組在適當?shù)臈l件下能夠通過鏈內堿基配對形成雙鏈分子。

以US7465583B2為基礎，北卡羅萊納大學教堂山分校遞交了一系列的分案和延續(xù)案申請，其中分案US7790154B2保護一種細小病毒顆粒，包含細小病毒衣殼蛋白和載體基因組，其中載體基因組從5’到3’方向上包含5’細小病毒末端重復、第一異源核苷酸序列、修飾的細小病毒末端重復、單獨的異源核苷酸序列和3’細小病毒末端重復，其中第一和第二異源核苷酸序列基本上是自身互補的。

嵌合AAV衣殼技術（Chimeric Capsids）

AAV載體的靶向性依賴于其衣殼蛋白與細胞表面受體的相互作用。AskBio的嵌合技術通過對天然存在的AAV衣殼蛋白進行修飾，構建了AAV變體衣殼庫，可以介導特定組織外源基因的高效遞送，而且得到的嵌合AAV載體可以逃避體內免疫系統(tǒng)中抗AAV抗體的攻擊。

參見：AskBio官網(wǎng)

針對該嵌合衣殼蛋白技術，北卡羅萊納大學教堂山分校遞交了多項專利申請對其進行保護。

如PCT/US2016/066466對應的中國專利申請CN108602859A的權利要求1為：

涉及一種修飾的細小病毒衣殼蛋白，該申請?zhí)幱趯彶殡A段，尚未獲得授權。

依托該嵌合衣殼蛋白技術，AskBio開發(fā)出了多種類型的嵌合AAV載體，如雙糖鏈受體嵌合載體等。

雙糖鏈受體嵌合載體

在大多數(shù)情況下，一類AAV主要利用一種聚糖結合位點轉染細胞，如AAV2和AAV3依賴硫酸乙酸肝素（HS）；AAV4和AAV5依賴唾液酸（Sia）；AAV9依賴半乳糖（Gal）。其中比較特殊的是AAV6，它可以識別Sia和HS，但研究發(fā)現(xiàn)僅Sia是AAV6轉導所必需的。

AskBio通過對AAV衣殼蛋白的氨基酸進行定點誘變，獲得可以識別不同聚糖的AAV載體，這類嵌合AAV載體可以通過不同的聚糖受體轉染宿主細胞。

2013年，北卡羅萊納大學教堂山分校遞交了涉及雙重聚糖結合AAV載體的國際申請PCT/US2014/028545。

PCT/US2014/028545進入中國國家階段的專利申請CN105163764A的權利要求1為：

請求保護一種AAV衣殼蛋白，其包含一個或多個氨基酸取代，所述取代將新的聚糖結合位點引入AAV衣殼蛋白內。

CN105163764A的同族美國專利已經(jīng)獲得專利權（US10077291B2）。US10077291B2的權利要求1保護一種AAV2的衣殼蛋白，限定了引入AAV2衣殼蛋白上的氨基酸突變。

US10077291B2的權利要求3保護一種AAV8衣殼蛋白，限定了引入AAV8衣殼蛋白上的氨酸突變。

AskBio的研發(fā)管線

AskBio專有的Pro10^TM是通用的AAV規(guī)模化生產(chǎn)系統(tǒng)，為一種適應懸浮生長的HEK293細胞系。Pro10^TM生產(chǎn)的AAV病毒載體的滴度可達10¹⁷，該生產(chǎn)能力可以支持長期臨床開發(fā)的需求。

目前AskBio正在進行多個領域疾病AAV基因療法的開發(fā)。如由AskBio拆分出的Actus Therapeutics和NanoCor Therapeutics分別負責研發(fā)的ACTUS-101和Carfostin。

參見：AskBio官網(wǎng)

ACTUS-101

ACTUS-101是Actus Therapeutics負責研發(fā)的針對龐貝?。≒ompe）的AAV基因療法，通過靜脈注射輸注轉導肝臟細胞。

Pompe是由肌肉中酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）缺乏引起糖原在組織器官尤其是肌肉中積累的遺傳病，常導致過早死亡，目前尚無有效的治療方案。預臨床試驗數(shù)據(jù)表明，ACTUS-101可以在體內細胞中連續(xù)生產(chǎn)GAA。

目前，Actus正在開展ACTUS-101針對Pompe的1/2期臨床研究。

Carfostin

Carfostin是NanoCor Therapeutics負責研發(fā)的針對充血性心力衰竭（CHF）的AAV基因療法，通過股動脈輸送至冠狀動脈感染受損的心肌細胞。

CHF往往是心臟病的最后階段，表現(xiàn)為心肌僵硬，心臟無法向身體提供足夠量的血液和氧氣。Carfostin能將蛋白磷酸酶1抑制劑遞送至受損的心臟細胞中并且靶向1型蛋白磷酸酶，后者是鈣循環(huán)和心肌細胞收縮的負調節(jié)劑。

結語

除NanoCor和Actus外，AskBio還成功拆分出Bamboo Therapeutics和Chatham Therapeutics。前者專注于杜氏肌營養(yǎng)不良AAV基因療法的開發(fā)（2016年AskBio將其出售給輝瑞）；后者專注于血友病的AAV基因療法的開發(fā)（2014年AskBio將其出售給Baxter）。

AskBio擁有開發(fā)AAV基因療法的技術優(yōu)勢及專利組合，當某個候選藥物具有商業(yè)開發(fā)價值后，AskBio通過拆分出專門的生物技術公司，向其提供技術支持及許可相關的知識產(chǎn)權來促進產(chǎn)品的研發(fā)。

AskBio將知識產(chǎn)權與業(yè)務運營區(qū)分開來的模式可以提高管理效率，使其成為制藥和生物技術公司極具吸引力的合作伙伴。

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