2017年10月的第18屆世界肺癌大會（WCLC）上，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科暨上海市呼吸病研究所胡潔教授團隊的童琳博士就報告了胸水上清的研究，證實胸水上清ctDNA具有更高的腫瘤特有突變檢出率和敏感性。憑借這項研究摘要，她獲得了2017 WCLC的Travel Award（旅行獎）。³

▲?2017年WCLC，胡潔教授團隊的童琳博士所作報告

時隔近兩年，2019年7月28日，該項研究結(jié)果正式發(fā)表于《Theranostics》雜志（IF=8.063），通過比較分析胸水上清、細胞沉渣、組織切片及外周血4種樣本的基因圖譜，進而證實了胸水上清標本進行基因檢測的有效性和準確性，并進一步證實胸水上清標本在臨床應(yīng)用可能性。⁴

▲?2019年《Theranostics》發(fā)表胡潔教授團隊研究結(jié)果

▲?胸水上清研究方案路徑及臨床指導(dǎo)意義

63例轉(zhuǎn)移性肺癌患者，根據(jù)有無匹配腫瘤樣本分為兩個隊列，隊列1有匹配組織樣本（n=30），隊列2無匹配組織樣本（n=33）。同時采集每位患者的胸水和血漿樣本。分別對胸水上清和細胞沉渣進行DNA提取，分別簡稱為胸水上清細胞游離DNA（PE-cfDNA）和細胞沉渣DNA（sDNA）。所有樣本都使用了南京世和基因 416基因?NGS大panel 進行測序。

▲ 63例患者登記和樣本收集的研究設(shè)計

血漿ctDNA檢測：EDTA抗凝管采集 8~10ml外周血，2h內(nèi)采用兩步離心法分離出血漿和血細胞，血漿做ctDNA檢測，血細胞（白細胞）做對照檢測；

腫瘤組織檢測：FFPET 樣本由病理學(xué)家測定每個樣本的腫瘤細胞含量，然后進行組織的基因檢測；

胸水樣本檢測：采集3~6ml胸水樣本，用2500g離心15min，將上清液與漂浮細胞分離，上清液抽提PE-cfDNA，細胞沉渣（需要細胞涂片在400X倍鏡下評估腫瘤細胞含量）抽提sDNA；

文庫制備：KAPA Hyper Prep Kit；

測序方法：Illumina HiSeq 4000平臺，2×150bp 雙端測序；

檢測靈敏度：腫瘤組織和細胞沉渣?0.5%，血液和胸水上清 0.1%，準確判斷至少需要存在三條獨立的reads（GATK）。

①?胸水上清中ctDNA（PE-cfDNA）含量遠高于胸水沉渣細胞DNA（sDNA）和血漿ctDNA。提示PE-cfDNA具有更高的突變檢出率及更高的突變檢出豐度：胸水上清（98.4%）>胸水細胞（90.5%）>外周血（87%），避免血檢造成的假陰性。

②?在匹配腫瘤組織的隊列1中，PE-cfDNA的腫瘤突變負荷（TMB）與腫瘤組織相似（中位TMB 6.4 vs?5.6)，但明顯高于胸水細胞沉渣 sDNA（中位TMB 3.3）和血漿cfDNA（中位TMB 3.4）。

▲ 四種樣本類型檢測TMB的情況對比

③?在組織檢測的驅(qū)動突變中，93%（27/29）在PE-cfDNA中檢測到，包括ALK、BRAF、EGFR、ERBB2、KRAS、NF1、PIK3CA 和 RET 的突變，而在血漿 cfDNA 中檢出率僅有 62%。在整個隊列中，PE-cfDNA對EGFR驅(qū)動突變的檢出率最高：胸水上清（71%）>胸水細胞（68%）>外周血（59%），避免血檢造成的假陰性。

④?比較分析ARMS-PCR和NGS檢測不同樣本EGFR突變的情況。證明NGS的方法是可行的，且胸水上清樣本檢出率是最高的。

▲ A) ARMS和NGS檢測不同樣本EGFR突變；B) NGS總檢出率。

⑤?胸水上清可克服胸水細胞學(xué)陰性和血性胸水檢測突變的困難。即使是細胞學(xué)陰性，胸水上清 PE-cfDNA 仍可能檢出突變；即使是血性胸水含有有核細胞，導(dǎo)致腫瘤細胞被稀釋而降低胸水細胞沉渣的突變檢測敏感性，但胸水上清的檢出率并不受影響。PE-cfDNA與 sDNA 在血性胸水和非血性胸水中的檢測靈敏度分別為：72% vs 81%，34% vs 64%。

在這種情況下，我們可發(fā)現(xiàn) PE-cfDNA 比 sDNA 表現(xiàn)出絕對優(yōu)勢，說明 PE-cfDNA 是腫瘤DNA的獨立來源，受腫瘤細胞豐度影響較小。

▲ C) 胸腔積液腫瘤細胞（+）或腫瘤細胞（-）中PE-cfDNA和sDNA檢測的靈敏度對比；D) 血性胸水和非血性胸水中PE-cfDNA和sDNA檢測的靈敏度對比。

當腫瘤組織不可用時，PE-cfDNA比 sDNA 和 血漿cfDNA 更適合用于基因組分析，而且可能更精細，是一種很有前途的腫瘤組織替代物。

研究數(shù)據(jù)進一步證明，在細胞學(xué)陰性或血性胸水標本中，PE-cfDNA比 sDNA 和 血漿cfDNA?具有更高的突變檢測靈敏度，是一種更可靠的基因檢測標本來源。

臨床中，胸水樣本檢測應(yīng)如何采集處理？

2018年《中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表的《液體活檢在臨床腫瘤診療應(yīng)用和醫(yī)學(xué)檢驗實踐中的專家共識》，對胸水樣本的采集及處理提出了應(yīng)用的建議：臨床醫(yī)師可通過胸膜腔穿刺術(shù)，采集胸腔積液 20 ml 置于預(yù)添加 EDTA 抗凝劑的無菌容器中（采集量視具體情況而定），采集完畢應(yīng)即刻送至檢測實驗室，常溫保存。建議 2 h 內(nèi)完成兩步離心分離上清（同血漿分離步驟），分離后的上清可直接進行抽提或保存于 -80 ℃冰箱直至抽提。^6?

如果需要長途保存運輸，亦可采用cfDNA管（比如Streck管）采集胸腔積液 8~10ml 兩管（約20ml左右），顛倒混勻后，常溫（6~37℃）保存運輸。cfDNA管中的游離DNA保護液不僅可以防RBC溶血，防WBC基因組DNA污染，還可以抑制核酸酶降解游離DNA。（基因Talks建議，僅供參考）

參考資料：

1.Wan Jonathan C M,Massie Charles,Garcia-Corbacho Javier et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA.[J] .Nat. Rev. Cancer, 2017, 17: 223-238.

2.Abbosh Christopher,Birkbak Nicolai J,Wilson Gareth A et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution.[J] .Nature, 2017, 545: 446-451.

3.Tong L, Ding N, Li J, et al. MA 20.13 etDNA: Tumor-Derived DNA from Pleural Effusion Supernatant as a Promising Source for NGS-Based Mutation Profiling in Lung Cancer[J]. Journal of Thoracic Oncology, 2017, 12(11): S1891.

4.Tong L, Ding N, Tong X, Li J, Zhang Y, Wang X, Xu X, Ye M, Li C, Wu X, Bao H, Zhang X, Hong Q, Song Y, Shao YW, Bai C, Zhou J, Hu J. Tumor-derived DNA from pleural effusion supernatant as a promising alternative to tumor tissue in genomic profiling of advanced lung cancer.?Theranostics?2019; 9(19):5532-5541.

5.Gandara David R,Paul Sarah M,Kowanetz Marcin et al. Blood-based tumor mutational burden as a predictor of clinical benefit in non-small-cell lung cancer patients treated with atezolizumab.[J] .Nat. Med., 2018, 24: 1441-1448.

6.《液體活檢在臨床腫瘤診療應(yīng)用和醫(yī)學(xué)檢驗實踐中的專家共識》,中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志2018年10月第41卷第10期.

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