長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long coding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本水平超過(guò)200nt、不編碼蛋白的RNA。LncRNA起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，不具備生物學(xué)功能。然而，近幾年的研究表明lncRNA能在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)、參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要調(diào)控過(guò)程，與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展和防治都有密切聯(lián)系。

● 技術(shù)重復(fù)性高：同一樣本重復(fù)建庫(kù)相關(guān)性Pearson值大于0.993
● 高特異性：使用特定方法降低樣本中rRNA的豐度
● 高準(zhǔn)確度：構(gòu)建鏈特異性轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，快速、高效、準(zhǔn)確地獲取樣本中幾乎全部的lncRNA序列及其位置信息
● 分析嚴(yán)格：系統(tǒng)鑒定已知lncRNA，設(shè)置嚴(yán)格的篩選條件用于發(fā)現(xiàn)新的lncRNA
● lncRNA深入分析：lncRNA cis和trans調(diào)控機(jī)制以及ceRNA調(diào)控機(jī)制等
● 經(jīng)驗(yàn)豐富：已對(duì)多種動(dòng)植物的lncRNA進(jìn)行測(cè)序分析

● 測(cè)序平臺(tái)：Hiseq X 10/Nova seq
● 測(cè)序類型：PE150
● 測(cè)序數(shù)據(jù)量：10 G/樣本

1) 樣品純度：OD 260/280值應(yīng)在1.9～2.2 之間。
2) 樣品濃度：最低濃度不低于100ng/ul。
3) 樣品總量：每個(gè)樣品總量不少于2μg。
4) 樣品溶劑：總RNA溶解于DEPC-水或者RNase-free的緩沖液中。
5) 樣品運(yùn)輸： RNA用凍存管保存，并用干冰或液氮運(yùn)輸。

一、標(biāo)準(zhǔn)分析：

1) 原始數(shù)據(jù)預(yù)處理：去除接頭污染、低質(zhì)量序列得到clean data，去除核糖體RNA數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)及測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估。
2) 序列拼接比對(duì)：比對(duì)分析、數(shù)據(jù)拼接為后續(xù)做準(zhǔn)備；基因組mapping，轉(zhuǎn)錄本組裝。
3) lncRNA篩選及注釋：已知lncRNA（采用NONCODE、lncrnadb、Ensembl、NCBI、UCSC等多個(gè)lncRNA數(shù)據(jù)庫(kù)的集合或者自定義數(shù)據(jù)庫(kù)篩選并注釋已知lncRNA；）；多種算法（PhyloCSF預(yù)測(cè)算法與CPC預(yù)測(cè)算法）預(yù)測(cè)新的lncRNA。
4) lncRNA定量及差異分析：差異分析需2個(gè)或2個(gè)樣品以上。
5) 差異lncRNA靶基因預(yù)測(cè)：通過(guò)共表達(dá)或者位置關(guān)系分析lncRNA的靶基因。
6) 差異轉(zhuǎn)錄本分析：利用軟件比較各轉(zhuǎn)錄本在不同樣本間的差異表達(dá)，篩選差異轉(zhuǎn)錄本。
7) 結(jié)構(gòu)分析：AS/SNP/InDdel分析，分析轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變化。
8) 功能通路富集分析：差異lncRNA靶基因的GO analysis；差異lncRNA靶基因的pathway analysis。

二、高級(jí)數(shù)據(jù)分析

● Gene Expression Trend Analysis (時(shí)序分析)

   對(duì)于按照處理時(shí)間、濃度、疾病惡化程度順序設(shè)計(jì)的序列實(shí)驗(yàn)，為了篩選出隨樣本順序變化影響最顯著、最主流的lncRNA群，需要對(duì)樣品的差異lncRNA進(jìn)行表達(dá)趨勢(shì)分析。應(yīng)用模糊聚類等機(jī)器學(xué)習(xí)方法，計(jì)算出隨著時(shí)間、濃度梯度或惡性程度等變化過(guò)程中l(wèi)ncRNA的表達(dá)趨勢(shì)，得到相應(yīng)的主流表達(dá)趨勢(shì)，其所屬lncRNA的表達(dá)變化與時(shí)間、濃度、惡性程度具有顯著性聯(lián)系的lncRNA，主流表達(dá)趨勢(shì)所屬lncRNA將作為進(jìn)一步研究的目標(biāo)基因。

 ● Co expression Network(lncRNA-mRNA)

    Co expression Network是分析lncRNA與mRNA相互作用關(guān)系的創(chuàng)新工具。Coexpression Network根據(jù)lncRNA及mRNA的實(shí)測(cè)值，通過(guò)共表達(dá)計(jì)算方法構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)lncRNA周邊與其共表達(dá)的mRNA來(lái)預(yù)測(cè)未知lncRNA的功能。Coexpression Network可以幫助發(fā)現(xiàn)lncRNA與mRNA之間可能存在的作用關(guān)系，能夠找到影響mRNA表達(dá)的lncRNA，從而發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中起中心調(diào)控作用的lncRNA及發(fā)現(xiàn)lncRNA可能存在的新作用機(jī)制。由于共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是基于芯片的實(shí)測(cè)表達(dá)值運(yùn)算的結(jié)果，故而突破了傳統(tǒng)分析中基因注釋不齊全的限制，大大增加了研究的創(chuàng)新性。結(jié)果樣式如下：

● lncRNA Target Pathway Network

       根據(jù)差異lncRNA和被調(diào)控靶基因的顯著性通路，利用lncRNA和靶基因通路的屬性，構(gòu)建lncRNA Target Pathway Network。該網(wǎng)絡(luò)反映目標(biāo)lncRNA對(duì)Pathway的作用關(guān)系。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中各lncRNA的位置函數(shù)計(jì)算出網(wǎng)絡(luò)特征值。特征值最高的lncRNA處于網(wǎng)絡(luò)的樞紐性地位，該lncRNA對(duì)多個(gè)Pathway和樣本狀態(tài)有重要的調(diào)控價(jià)值，同時(shí)，評(píng)價(jià)Pathway在網(wǎng)絡(luò)中的特征值，可以發(fā)現(xiàn)差異lncRNA所調(diào)控的核心通路。

● ceRNA Network

     分別對(duì)miRNA與mRNA、miRNA與lncRNA進(jìn)行靶向預(yù)測(cè)，并根據(jù)表達(dá)趨勢(shì)取負(fù)相關(guān)。根據(jù)結(jié)果找出具有mRNA-miRNA-lncRNA關(guān)系的mRNA/lncRNA對(duì)。計(jì)算差異基因和差異lncRNA間的共表達(dá)關(guān)系，挑選出互為正相關(guān)的基因與lncRNA。根據(jù)上述分析結(jié)果，選出存在于mRNA-miRNA-lncRNA關(guān)系中，并互為正相關(guān)的mRNA/lncRNA對(duì)。這對(duì)mRNA/lncRNA即可能互為ceRNA，再通過(guò)MREs的數(shù)量和結(jié)合分值評(píng)估ceRNA的競(jìng)爭(zhēng)能力。結(jié)果樣式如下：