重要性

瘤內(nèi)異質(zhì)性（ITH）對于確定和跟蹤癌癥成為越來越受關(guān)注的主題。然而，ITH對臨床預(yù)后風(fēng)險的預(yù)測仍不清楚。本文描繪了由ITH驅(qū)動的患者分層，我們還提出在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中開發(fā)單扇區(qū)預(yù)測多基因檢測（MGT）時，應(yīng)考慮個體基因的ITH水平。

源自患者的富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）的單細(xì)胞分子分析，可進一步揭示預(yù)測轉(zhuǎn)移風(fēng)險的生物標(biāo)志物。通過對轉(zhuǎn)移譜多個步驟的基因進行系統(tǒng)分析，我們證明NSCLC復(fù)發(fā)早期患者具有精確的特征，可以據(jù)此識別高?；颊?。

摘要

盡管非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）不僅在腫瘤之間，而且在腫瘤內(nèi)都具有顯著的基因組和轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性，但是驗證臨床相關(guān)基因標(biāo)記的預(yù)測依賴于單個組織樣本，包括兩種商業(yè)上可獲得的多基因測試（MGTS）。

本文中，我們報告了瘤內(nèi)異質(zhì)性（ITH）對預(yù)測NSCLC復(fù)發(fā)風(fēng)險具有意料之外的影響，強調(diào)需要更好的基因組策略來改善預(yù)后。

利用無標(biāo)記、慣性聚焦微流體方法以單細(xì)胞分辨率捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC），我們進一步識別了具有不同轉(zhuǎn)移能力的CTC表達譜基因特征。

值得注意的是，調(diào)和ITH和CTC衍生基因表達數(shù)據(jù)的預(yù)后風(fēng)險精確模型，優(yōu)于預(yù)測無復(fù)發(fā)生存（RFS）的初始分類器。我們提出量身定制的方法來提供可靠的風(fēng)險評估，同時考慮到NSCLC中ITH驅(qū)動的變化幅度。

針對白種人吸煙肺癌患者群體的新興多區(qū)域測序提供了瘤內(nèi)異質(zhì)性（ITH）的基因證據(jù)。

正文

最近，我們觀察到一種復(fù)雜的基因組，盡管突變負(fù)擔(dān)低，但在不吸煙的亞洲非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中具有不同的拷貝數(shù)和早期多樣化。

這種ITH在多種分子水平上的臨床預(yù)后在其他類型癌癥中也變得明顯，表明ITH驅(qū)動的差異可能導(dǎo)致錯誤的患者分類。然而，目前沒有多基因檢測（MGT）支持ITH特征選擇，包括基于2個基因表達的肺癌患者MGT。

通過將預(yù)測多基因分類器應(yīng)用于多區(qū)域數(shù)據(jù)分析，我們首先描繪了轉(zhuǎn)錄組ITH，并檢查了ITH對NSCLC患者分層的混淆程度。

該分類器被稱為腫瘤基質(zhì)指數(shù)（TMi），已被證實其在2,000多名早期NSCLC患者中具備對預(yù)后和輔助化療反應(yīng)的預(yù)測價值。

TMi是基于29個基質(zhì)基因表達水平計算的，主要編碼非核心基質(zhì)蛋白，包括細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）調(diào)節(jié)因子（MMP12、MMP1、ADAMTS5）、ECM附屬蛋白（GREM1、SFTPC、SFTPA2、SFTPD、FCN3）、分泌因子（S100A2、CXCL13、WIF1、CHRDL1、CXCL2、IL6、HHIP、S100A12）和其他ECM相關(guān)成分（LPL、CPB2、MAMDC2、CD36），以及包括膠原蛋白（COL11A1, COL10A1, COL6A6)）和ECM糖蛋白（SPP1、CTHRC1、TNNC1、ABI3BP、PCOLCE2）在內(nèi)的核心基質(zhì)分子，與匹配的無腫瘤組織相比，我們發(fā)現(xiàn)這些成分在NSCLC中存在更加差異化的表達。

我們發(fā)現(xiàn)，盡管TMi是有效的預(yù)后預(yù)測因子，但是大量的TMi基因顯示出顯著的ITH并導(dǎo)致同一腫瘤內(nèi)的不一致分布（同時具備低TMi和高Tmi區(qū)域），這表明需要基于ITH水平和患者異質(zhì)性（IPH）重建基因特征，正如新近對乳腺癌MGT提出的那樣。

我們假設(shè)，在原發(fā)性腫瘤侵襲過程中伴隨腫瘤進展的異常matrisomal表達模式也可能是有用的，因此可以在轉(zhuǎn)移的晚期進程中表現(xiàn)出來，如出現(xiàn)在循環(huán)血中。

因此，除了多區(qū)域原發(fā)性腫瘤組織外，我們還評估了循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC），以描述預(yù)后性TMi特征的腫瘤內(nèi)表型變異。

最近的單細(xì)胞測序研究表明，時空異質(zhì)性CTC可以監(jiān)測各種轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的基因組和轉(zhuǎn)錄組水平。

雖然單個腫瘤活檢可能并不能代表含有空間隔離克隆的整個腫瘤，但CTC的空間和時間變化可能會重現(xiàn)在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥的基因表達和途徑。

我們進一步采用單細(xì)胞而非大量細(xì)胞分析來排除可能的白細(xì)胞污染，這在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中尤為明顯，當(dāng)活化的白細(xì)胞同時過度表達癌癥相關(guān)基因、上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型和干細(xì)胞標(biāo)記物。鑒于間充質(zhì)和造血特性，CTC特異性轉(zhuǎn)錄物的表達分析復(fù)雜化。

我們小組最近開發(fā)了一個集成的ClearCell FX和微流體平臺工作流程，以：

1）測量來自單個患者的CTC全長mRNA轉(zhuǎn)錄組
2）檢測在匹配的原發(fā)性腫瘤中發(fā)現(xiàn)的顯性突變。

兩項研究中的高質(zhì)量測序性能指標(biāo)證明了ClearCell FX富集CTC的遺傳完整性，證明了將無標(biāo)記、標(biāo)記非依賴性微流體技術(shù)納入下游分子分析和功能研究的可行性。

最近在不同的外部實驗室進行的單細(xì)胞測序研究進一步證實，通過DEPArray技術(shù)分離的富含ClearCell FX的CTC或經(jīng)過全基因組擴增（WGA）的顯微操作器提取的DNA質(zhì)量高、適合測序、顯示出穩(wěn)健性。

通過對2,748個患者樣本進行系統(tǒng)的計算機驗證，我們進一步表明，新開發(fā)的風(fēng)險模型僅包含單個CTC衍生的特征，專門針對ITH水平定制，具有強大的預(yù)測能力，可用于預(yù)測基于組織的樣本的無復(fù)發(fā)生存期（RFS），此類方法可能取代先前確定NSCLC復(fù)發(fā)高風(fēng)險早期疾病患者的方法。 

結(jié)果

ITH驅(qū)動的患者錯誤分類

為了檢驗ITH對風(fēng)險預(yù)測的影響，我們分析了最近發(fā)表的2項研究的手術(shù)樣本（每個腫瘤3或4個區(qū)域）的多區(qū)域基因表達譜，使用預(yù)后性TMi基因組。我們首先檢查了TMi的診斷和預(yù)后準(zhǔn)確性。在研究1中，TMi在區(qū)分正常和腫瘤樣本方面取得了極好的診斷準(zhǔn)確性，包括來自20個早期NSCLC腫瘤的80個區(qū)域和20個匹配的正常肺組織，其中敏感性、特異性ROC曲線下面積均為100％。

為了測試TMi的預(yù)后性，我們將研究2的10名NSCLC患者的35個區(qū)域根據(jù)無復(fù)發(fā)生存（RFS）分析的理想分界指數(shù)分為低TMi和高TMi組。在這個小型患者隊列中，預(yù)測由模型復(fù)發(fā)的腫瘤具有顯著更差的預(yù)后，證明了TMi對RFS預(yù)測的穩(wěn)健預(yù)測值。

討論

CTC的單細(xì)胞分析揭示了臨床上有用的拷貝數(shù)變異和點突變，同時解決了肺癌的異質(zhì)性程度。然而，這些發(fā)現(xiàn)僅與表達上皮標(biāo)志物的CTC相關(guān)，缺失去分化的EpCAM-或間充質(zhì)/ EMT樣CTC，這些都與疾病進展和治療反應(yīng)密不可分。

通過依賴無標(biāo)記方法，我們發(fā)現(xiàn)NSCLC腫瘤的轉(zhuǎn)移潛力在于其在基質(zhì)表達中的異質(zhì)性特征，其反過來反映在CTC群體中。

根據(jù)支持EMT對CTC表型貢獻的非排他性假設(shè)的結(jié)果，原發(fā)腫瘤中的TMi高細(xì)胞可能在功能上具備其在血流和轉(zhuǎn)移性生態(tài)位形成中所需的關(guān)鍵特性，特別是考慮到基質(zhì)和EMT。

在最近的臨床研究中，表達間充質(zhì)特征的CTC重復(fù)性與轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)相關(guān)，它們在器官特異性轉(zhuǎn)移中的異質(zhì)性的作用，進一步指向這些侵襲性細(xì)胞作為預(yù)測轉(zhuǎn)移的主要成分。

致謝

這項工作是在新加坡國立大學(xué)（NUS）生物醫(yī)學(xué)工程系的MechanoBioEngineering實驗室構(gòu)思和實施的。

論文信息：

Addressingcellular heterogeneity in tumor and circulation for refined prognostication. PNAS September3, 2019 116 (36) 17957-17962