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A Novel AR Translational Regulator lncRNA LBCS Inhibits Castration Resistance Of Prostate Cancer 一種新型AR翻譯調(diào)節(jié)因子lncRNA-LBCS抑制前列腺癌去勢抵抗 期刊：Molecular Cancer 影響因子：10.679 發(fā)表單位：中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院泌尿外科 導(dǎo) 讀 先前的文章中我們介紹了lncRNA招募激酶促進(jìn)靶蛋白磷酸化的機(jī)制“lncRNA結(jié)合蛋白調(diào)控機(jī)制文章（11.878）”。本篇文章繼續(xù)探討lncRNA的的機(jī)制，在我們公司做過lncRNA測序的老師，會(huì)發(fā)現(xiàn)lncRNA的靶基因調(diào)控機(jī)制，trans機(jī)制中有差異mRNA與lncRNA結(jié)合位點(diǎn)，自由能預(yù)測。老師可能不理解怎么使用。今天他來了，這篇文章講解了lncRNA與靶基因mRNA結(jié)合抑制其翻譯，達(dá)到調(diào)控的目的。 摘 要 背景：進(jìn)展到去勢抵抗?fàn)顟B(tài)是前列腺癌(PCa)患者死亡的主要原因。雄激素受體(AR)信號(hào)傳導(dǎo)在去勢抗性前列腺癌(CRPC)的進(jìn)展中起著核心作用，因此了解低雄激素環(huán)境下AR激活的機(jī)制對(duì)于發(fā)現(xiàn)治療CRPC的新途徑至關(guān)重要。 方法：首先，我們通過轉(zhuǎn)錄組微陣列來探索CRPC相關(guān)的lncRNA。在三個(gè)獨(dú)立的大規(guī)模隊(duì)列中分析lnc-LBCS的表達(dá)和臨床特征。通過體外功能獲得和喪失實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究了lnc-LBCS的功能作用和機(jī)制。 結(jié)果：Lnc-LBCS在CRPC細(xì)胞系和組織中表達(dá)較低。LBCS下調(diào)與PCa患者Gleason評(píng)分高、T分期及預(yù)后不良相關(guān)。LBCS過表達(dá)減少，而LBCS敲低增加，在雄激素消融或AR阻斷條件下前列腺癌細(xì)胞的去勢抗性特征。此外，LBCS敲低足以在沒有雄激素的情況下通過提高AR蛋白的翻譯來激活A(yù)R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在機(jī)制上，LBCS直接與hnRNPK相互作用，通過與hnRNPK和AR mRNA形成復(fù)合物來抑制AR翻譯效率。 結(jié)論：LNC-LBCS作為一種新型的AR翻譯調(diào)節(jié)因子，通過與hnRNPK相互作用抑制前列腺癌的去勢抵抗。這為lncRNA介導(dǎo)的AR激活對(duì)CRPC的調(diào)節(jié)提供了新的見解，LBCS-hnRNPK-AR軸為CRPC的治療提供了一種有前景的方法。 結(jié) 果 1 在CRPC細(xì)胞中，LBCS明顯下調(diào) 在我們之前的研究中，我們報(bào)道了LNCaP細(xì)胞及其兩個(gè)抗去勢亞系LNCaP-AI和LNCaP-Bic中不同表達(dá)的lncRNA。我們之前發(fā)現(xiàn)HOXD-AS1在CRPC細(xì)胞中過表達(dá)，在本研究中我們關(guān)注下調(diào)的lncRNAs。我們發(fā)現(xiàn)了一種名為LBCS的新型lncRNA，它是以前報(bào)道的微陣列結(jié)果中CRPC細(xì)胞中下調(diào)最多的lncRNA之一（通過表達(dá)譜芯片、lncRNA測序找lncRNA）。最近的研究發(fā)現(xiàn)，LBCS通過誘導(dǎo)hnRNPK-EZH2復(fù)合物抑制SOX2的表達(dá)，從而抑制膀胱癌干細(xì)胞的自我更新、化療抗性和腫瘤啟動(dòng)（這個(gè)lnc在膀胱癌中研究過，本實(shí)驗(yàn)中沒有）。然而，LBCS在PCa進(jìn)展中的生物學(xué)功能和機(jī)制尚不清楚。然后我們通過實(shí)時(shí)定量qPCR證實(shí)LBCS是CRPC細(xì)胞系中下調(diào)最多的lncRNA之一(圖1A)。此外，我們觀察到隨著雄激素消融時(shí)間的延長，LBCS的表達(dá)逐漸降低(圖1B)，與LNCaP細(xì)胞相比，LBCS在雄激素非依賴性細(xì)胞22Rv1中的表達(dá)也較低(圖1C)。 2 LBCS與PCa的臨床特征和良好的預(yù)后相關(guān) 為了研究LBCS是否參與臨床PCa的進(jìn)程，我們檢測并分析了三組獨(dú)立的PCa樣本中LBCS的表達(dá)。首先，我們用原位雜交(ISH)方法分析了它在包含130個(gè)PCa和32個(gè)良性前列腺肥大(BPH)組織的隊(duì)列1中的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，與BPH組織相比，PCa中LBCS的表達(dá)顯著降低(圖1D-E)。有趣的是，CRPC患者中與激素敏感型前列腺癌(HSPC)患者相比(圖1D，F(xiàn))，在T3-4腫瘤中與T1-2相比(圖1G)，在Gleason評(píng)分為8-10的組織中與6-7相比(圖1H)，LBCS的表達(dá)也明顯下調(diào)。進(jìn)一步分析顯示LBCS表達(dá)與隊(duì)列1中的T分期和Gleason評(píng)分密切相關(guān)。為了進(jìn)一步證實(shí)LBCS在PCa患者中的臨床意義，我們分析了來自腫瘤基因組圖譜(TCGA)的大規(guī)模RNA-seq數(shù)據(jù)集和相應(yīng)的臨床信息。共納入374例PCa和52例BPH組織。我們發(fā)現(xiàn)，與BPH組織相比，PCa中LBCS的表達(dá)顯著下調(diào)(圖1L)。這些數(shù)據(jù)表明，LBCS可能在PCa的引發(fā)和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。（自己收集樣品及公共數(shù)據(jù)分析lnc的表達(dá)差異） 3 LBCS恢復(fù)CRPC細(xì)胞的去勢敏感性 為了探討LBCS在PCa進(jìn)展中的生物學(xué)作用，我們首先通過慢病毒穩(wěn)定地過表達(dá)或敲低PCa細(xì)胞中LBCS的表達(dá)。在去勢條件下，LBCS過表達(dá)降低了去勢抗性LNCaP-Bic和LNCaP-AI在An-drogen消融培養(yǎng)基中的增殖，并且，LBCS的消耗促進(jìn)雄激素敏感的LNCaP細(xì)胞的增殖。與細(xì)胞生長結(jié)果一致的是，與對(duì)照細(xì)胞相比，過表達(dá)的LBCS形成的CRPC細(xì)胞集落明顯較少且較小，而LBCS敲低，LNCaP細(xì)胞形成的集落較多且較大。此外，我們發(fā)現(xiàn)在LNCaP-AI和LNCaP-Bic細(xì)胞中，LBCS過表達(dá)顯著地增加了G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量，而減少了S期的細(xì)胞數(shù)量。相反，LBCS沉默顯著增加了LNCaP細(xì)胞中S期的細(xì)胞數(shù)量，流式細(xì)胞術(shù)檢測到這一點(diǎn)。這些數(shù)據(jù)表明，在去雄激素條件下，LBCS抑制PCa細(xì)胞的細(xì)胞活性。（過表達(dá)敲低lnc，查看細(xì)胞的增殖凋亡等） 4 LBCS抑制AR蛋白翻譯并抑制AR信號(hào)激活 最后，為了檢查LBCS是否影響AR泛素化，一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)LBCS不影響AR蛋白的泛素化。我們的結(jié)果表明LBCS的敲低促進(jìn)AR蛋白翻譯，而不是泛素化或蛋白酶體介導(dǎo)的降解。此外，我們進(jìn)一步驗(yàn)證敲低LBCS是否直接激活A(yù)R信號(hào)。我們使用位點(diǎn)特異性引物對(duì)幾個(gè)已知的AR靶基因進(jìn)行抗AR抗體的CHIP-qPCR。我們的數(shù)據(jù)證實(shí)，LBCS下調(diào)確實(shí)增加了對(duì)PSA，TMPRSS2和OPRK1啟動(dòng)子的AR和Pol-II招募，導(dǎo)致AR信號(hào)激活。（如何確定通路激活，通過的基因改變，靶基因改變。如何確定某個(gè)基因激活，看其靶點(diǎn)是否改變） 我們的數(shù)據(jù)表明，LBCS是AR蛋白翻譯和AR信號(hào)激活的新型抑制因子。 5 LBCS與AR mRNA直接相互作用 LncRNA的亞細(xì)胞定位與其生物學(xué)功能密切相關(guān)。細(xì)胞分級(jí)分析和RNA熒光原位雜交(RNA FISH)顯示，LBCS在PCa細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，但主要分布在細(xì)胞質(zhì)中(下圖 A-B)，提示LBCS可能具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能（確定lnc定位，方便選擇調(diào)控機(jī)制）。以往的研究表明，翻譯調(diào)節(jié)元件主要位于5‘UTR區(qū)域。為了解決這個(gè)問題，我們通過克隆全長(FL)5’-UTR和5’-UTR和3’-UTR的不同片段作為對(duì)照，對(duì)熒光素酶載體進(jìn)行了熒光素酶分析。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)與psiCHECK2-5’-UTR共轉(zhuǎn)染LBCS時(shí)，熒光素酶活性顯著降低，而不是含有3’-UTR的載體(下圖 C-D)。此外，我們發(fā)現(xiàn)LBCS顯著抑制5’-UTR的 282-620區(qū)域的熒光素酶活性，但不抑制1-300，620-871和864-1115區(qū)域的熒光素酶活性(下圖 C)。通過序列預(yù)測，我們發(fā)現(xiàn)了三個(gè)潛在的LBCS-AR結(jié)合區(qū)(稱為AR1-3)。為了確認(rèn)精確的結(jié)合位點(diǎn)，使用體外合成的LBCS和AR 5’-UTR RNA區(qū)域進(jìn)行熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。在460 nm激發(fā)下，LBCS(164-184 nt)/AR組與對(duì)照RNA/AR組相比，580 nm處的釋放增加，而520 nm處的信號(hào)降低，但其他組沒有。這些數(shù)據(jù)表明，LBCS 164-184 nt區(qū)域直接與AR(Ar1)的5’-UTR 545-565 nt區(qū)域相互作用，而不與其他區(qū)域(Ar2，Ar3)相互作用。此外，我們通過RNA純化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了RNA分離，然后通過實(shí)時(shí)熒光定量qPCR檢測了LNCaP細(xì)胞中特異性AR mRNA區(qū)域的富集。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)與陰性對(duì)照LacZ探針相比，含有AR1區(qū)域的5’-UTR被LBCS探針富集，而不是其他區(qū)域(下圖 J)。同時(shí)，我們通過定點(diǎn)突變產(chǎn)生了含有突變體AR1區(qū)域的熒光素酶載體(下圖 K)。我們發(fā)現(xiàn)LBCS顯著抑制野生型AR1區(qū)的熒光素酶活性，但不抑制突變區(qū)的熒光素酶活性(下圖 L)。（推測AR的翻譯過程受阻，猜測是lnc與mRNA結(jié)合，導(dǎo)致其不能正常翻譯） 6 LBCS結(jié)合并募集hnRNPK與AR mRNA以抑制PCa中的AR翻譯 LncRNA通常通過與蛋白質(zhì)結(jié)合來發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能（前面的機(jī)制略簡單，增加lncRNA與蛋白結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用）。因此，我們應(yīng)用RNApull-down試驗(yàn)進(jìn)一步闡明了PCa細(xì)胞中LBCS的作用機(jī)制。銀染色顯示一條55kD左右的明顯差異帶，質(zhì)譜鑒定為異質(zhì)核核糖核蛋白K(HnRNPK)(下圖 A)。此外，我們使用western blotting證實(shí)了LBCS與hnRNPK的相互作用(下圖 B)。這一結(jié)果與我們最近在膀胱癌研究中的發(fā)現(xiàn)是一致的（從圖中可以看出，一個(gè)lnc能結(jié)合很多蛋白，當(dāng)然我們找有差異的）。有趣的是，先前的一份報(bào)告發(fā)現(xiàn)hnRNPK是AR翻譯的關(guān)鍵抑制因子，并且hnRNPK和AR在前列腺癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。然而，hnRNPK如何與AR結(jié)合的詳細(xì)機(jī)制尚不清楚。為了研究LBCS是否作為hnRNPK-AR相互作用的支架，我們進(jìn)行了RNA免疫沉淀(RIP)，發(fā)現(xiàn)hnRNPK抗體與IgG相比，LBCS和AR mRNA顯著富集(下圖 C)。 討 論 看了本文，可以學(xué)到以下幾條： 1. 通過lncRNA高通量測序/芯片找差異lnc，結(jié)合公共數(shù)據(jù)如（生存曲線）選中候選lnc, 結(jié)合qPCR等確定研究的lnc。 2. 尋找lncRNA的靶標(biāo)時(shí)，有很強(qiáng)的主觀性。有理由相信同一個(gè)lnc在細(xì)胞中可能同時(shí)發(fā)揮多種作用，多種機(jī)制。與重要的基因/復(fù)合物/通路關(guān)聯(lián)，做出機(jī)制的可能性更大。 3. 關(guān)注的基因，沒有差異，不要慌?？纯吹鞍资欠裼懈淖?，如果蛋白沒有改變，看看磷酸化，甲基化是否有改變。如果蛋白有改變，考慮蛋白的翻譯過程，降解過程異常。考慮lnc在這一塊的作用。 |
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