乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。全球每年約有1【)()萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌(肝癌)，肝癌患者巾，75以上由HBV所致。我國(guó)屬HBV感染地方性流行區(qū)。根據(jù)2006年全國(guó)乙型肝炎流行病學(xué)調(diào)查，我國(guó)現(xiàn)有的慢性HBV感染者約9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例，每年因HBV導(dǎo)致的肝硬化和肝癌死亡約3o余萬例，新發(fā)乙型肝炎病例約50～1O0萬例。乙肝防治是當(dāng)前及今后相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)要面臨的重要任務(wù)。

HBV是血源傳播性疾病，主要經(jīng)血(如不安全注射等)、母嬰及性接觸傳播。乙型肝炎病毒屬嗜肝DNA病毒科(hepadnavdae)，基因組長(zhǎng)約3．2kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。急性乙型肝炎病毒感染HBVDNA存在先陽性后消失的發(fā)展過程，慢性乙型肝炎病毒感染的自然史一般可分為4個(gè)期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活動(dòng)或低(非)復(fù)制期和再活動(dòng)期，其中免疫耐受期HBVDNA滴度較高(3v于20000IU·mU)，免疫清除期表現(xiàn)為血清HBVDNA滴度大于2000IU·mL，但一般低于免疫耐受期。非活動(dòng)或低(非)復(fù)制期可表現(xiàn)為HBVDNA持續(xù)低于最低檢測(cè)限。部分再活動(dòng)期患者表現(xiàn)為HBVDNA活動(dòng)性復(fù)制。但并不是所有HBV感染者都經(jīng)歷以上四期]。

HBV已發(fā)現(xiàn)有9個(gè)基因型(A～I(xiàn))，每個(gè)基因型又可分為不同亞型，且存在基因型之間的重組現(xiàn)象。我國(guó)已發(fā)現(xiàn)A、B、C、D基因型，中東部地區(qū)以B、c基因型占優(yōu)勢(shì)，其中北方地區(qū)(長(zhǎng)江以北)主要為C2亞型；南方大部分地區(qū)流行株為B2、C2、C1亞型，并有少部分D基因型；西部地區(qū)尤其是新疆地區(qū)以D基因型為主，西部藏族居民中以C／D重組基因型為主lA型和B1亞型罕見乙型肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查包括生物化學(xué)檢測(cè)(如血清ALT和AST、血清膽紅素、膽堿酯酶等)、HBV血清學(xué)檢測(cè)(乙肝五項(xiàng))以及HBVDNA、基因型和突變檢測(cè)。其中HBVDNA定量檢測(cè)可反映病毒復(fù)制水平，用于乙肝輔助診斷的指標(biāo)之一，還可通過對(duì)血中HBVDNA水平的監(jiān)測(cè)，用于HBV感染的診斷、治療適應(yīng)癥的選擇及抗病毒療效的判斷]

本文所指乙肝病毒核酸定量檢測(cè)試劑是指利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法，以乙肝病毒基因序列為檢測(cè)目的，對(duì)人血清、血漿中的乙肝病毒DNA進(jìn)行體外定量檢測(cè)的試劑。本文結(jié)合現(xiàn)行法規(guī)及該試劑自身特點(diǎn)詳述了其性能評(píng)價(jià)的要點(diǎn)，為試劑研發(fā)和注冊(cè)申報(bào)提供參考。

1各級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品的建立

采用滅活病毒的血清／血漿建立標(biāo)準(zhǔn)品，通過逐級(jí)標(biāo)化，建立校準(zhǔn)品和質(zhì)控品。制備的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品、二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品、用于制備商品化校準(zhǔn)品的儲(chǔ)備液以及不同基因型的陽性樣本均應(yīng)能夠溯源至國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品／國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。逐級(jí)標(biāo)化過程一般包括以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品／國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為校準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行賦值，以賦值后企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品為校準(zhǔn)品對(duì)企業(yè)二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行賦值，然后逐級(jí)對(duì)制備商品化校準(zhǔn)品的儲(chǔ)備液以及質(zhì)控品進(jìn)行賦值，建立完整的溯源鏈。

2分析性能研究的主要內(nèi)容

2．1核酸提取方法的提取效率驗(yàn)證

臨床標(biāo)本中可能含有各種PCR抑制物，因此，對(duì)于DNA提取試劑的選擇，除最大量釋放出目的DNA外，還應(yīng)包含核酸純化步驟，盡可能去除PCR抑制物及干擾物質(zhì)。應(yīng)對(duì)核酸提取純化方法的回收率進(jìn)行驗(yàn)證，或通過檢測(cè)已賦值樣本的相對(duì)回收率對(duì)提取效果進(jìn)行考察，同時(shí)考察前處理方法與后續(xù)步驟的適用性lg。

2．2靈敏度研究

靈敏度分析包含兩方面的內(nèi)容：最低檢出量和定量限。最低檢出量為具有95以上陽性檢出率的病毒水平，定量限為能夠符合準(zhǔn)確度要求的最低病毒水平。

使用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品／國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋并多次檢測(cè)確定最低檢出限。將多次(至少1O次)鋇0量的符合試劑準(zhǔn)確度要求的最低病毒水平作為最低定量限。應(yīng)用最低檢出限或接近最低檢出限的病毒濃度的不同基因型(至少包括國(guó)內(nèi)基因型中的B、C、D型)對(duì)最低檢出限和定量限進(jìn)行驗(yàn)證。

2．3線性范圍研究

線性范圍確定的研究應(yīng)使用高值臨床樣本(由可溯源至國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品／國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的方法定量)進(jìn)行梯度稀釋，稀釋劑應(yīng)使用經(jīng)確認(rèn)為陰性的混合人血清或血漿，應(yīng)包含不少于9個(gè)濃度(應(yīng)包含接近最低檢測(cè)限的臨界值濃度)，使用至少3個(gè)批次的試劑進(jìn)行試驗(yàn)。通過評(píng)價(jià)一定范圍內(nèi)的線性關(guān)系及各水平的準(zhǔn)確度確定該方法的線性范圍。

2．4準(zhǔn)確度研究

對(duì)測(cè)量準(zhǔn)確度的評(píng)價(jià)應(yīng)進(jìn)行與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(和／或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品)的比對(duì)研究、回收試驗(yàn)、方法學(xué)比對(duì)等試驗(yàn)研究。

2．4．1與國(guó)家(國(guó)際)標(biāo)準(zhǔn)品的比對(duì)研究

使用國(guó)家(國(guó)際)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗(yàn)證，考察與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果的符合情況。

2．4．2回收試驗(yàn)

用于評(píng)估定量檢測(cè)方法準(zhǔn)確測(cè)定加入純分析物的能力，結(jié)果用回收率表示?；厥赵囼?yàn)應(yīng)對(duì)檢測(cè)范圍內(nèi)的高中低值標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算各水平的相對(duì)回收率。

2．4．3與同類試劑的比對(duì)研究

采用國(guó)內(nèi)或國(guó)際普遍認(rèn)為性能較好的同類試劑作為比對(duì)試劑，被考核試劑與比對(duì)試劑同時(shí)檢測(cè)一批病人樣品，從測(cè)定結(jié)果間的相關(guān)性了解試劑間的一致情況。

2．5精密度研究

測(cè)量精密度的前提是必須保證研究的科學(xué)合理性。應(yīng)對(duì)每項(xiàng)精密度指標(biāo)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。

2．5．1對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除試劑(包括提取組分和PcR組分)本身的影響外，還應(yīng)對(duì)PCR分析儀、操作者、地點(diǎn)等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。

2．5．2合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如：為期至少2O天的連續(xù)檢測(cè)，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測(cè)，從而對(duì)批內(nèi)／批間、日內(nèi)／日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。如有條件，應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)試進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)以對(duì)室間精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2．5．3用于精密度評(píng)價(jià)的質(zhì)控品應(yīng)至少包括四個(gè)水平

2．5．3．1陰性質(zhì)控品：不含HBVDNA的質(zhì)控品，不得檢出陽性(72≥2o)。

2．5．3．2臨界陽性質(zhì)控品：待測(cè)物濃度略高于試劑盒的最低檢測(cè)限，陽性檢出率應(yīng)高于959／6(≥2o)。

2．5．3．3弱陽性質(zhì)控品：待測(cè)物濃度呈弱陽性(高于定量限濃度1個(gè)數(shù)量級(jí))，陽性檢出率為100％且變異系數(shù)(CV)符合標(biāo)準(zhǔn)要求(n≥20)。

2．s．3．4強(qiáng)陽性質(zhì)控品：待測(cè)物濃度呈中度至強(qiáng)陽性，陽性檢…率為100且變異系數(shù)(CV)符合標(biāo)準(zhǔn)要求(”≥2O)。

2．6HBV不同基因型的覆蓋

應(yīng)對(duì)乙肝病毒不同基因型(至少包括B、C、D型)進(jìn)行檢測(cè)，重點(diǎn)考察各基因型病毒樣本的最低檢測(cè)限、準(zhǔn)確性及精密度指標(biāo)；每個(gè)基因型的病毒樣本稀釋成至少3個(gè)濃度水平，對(duì)每水平樣本進(jìn)行重復(fù)測(cè)定?？疾烀糠N基因型樣本的準(zhǔn)確度和精密度。

2．7分析特異性

2．7．1交叉反應(yīng)

2．7．1．1用于乙肝病毒核酸檢測(cè)試劑交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀以及臨床較為常見。如人巨細(xì)胞病毒、E-B病毒、人類免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、梅毒、人類皰疹病毒6型、白色念珠菌(CA)、單純皰疹病毒2型、單純皰疹病毒1型、甲型流感病毒、痤瘡丙酸桿菌(PA)、金黃色葡萄球菌(SA)等。

2．7．1．2建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。通常，細(xì)菌感染的水平為10。cfu·mU或更高，病毒為10pfu·1hE-或更高。

2．7．2干擾物質(zhì)

2．7．2．1潛在的干擾物質(zhì)主要包括：內(nèi)源性物質(zhì)(如人白蛋白、抗核抗體、游離血紅蛋白、甘油三酯、自身抗體、膽紅素、總IgG等)和常用的治療藥物如普通IFNa(2a、2b和lb)和聚乙二醇干擾素(2a和2b)[PegIFNc~(2a和2b)]、拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定等。

2．7．2．2使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物濃度進(jìn)行驗(yàn)證，建議在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(“最差條件”)條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)于常見藥物干擾試驗(yàn)，建議參照相應(yīng)藥物藥代動(dòng)力學(xué)研究確定的治療藥物濃度添加相應(yīng)藥物進(jìn)行干擾驗(yàn)證。

2．7．2．3建議在病毒的檢測(cè)臨界值水平對(duì)每種干擾物質(zhì)的干擾影響進(jìn)行檢測(cè)。

2．8溯源性

使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品／國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品為定標(biāo)品，應(yīng)用多臺(tái)儀器對(duì)企業(yè)一級(jí)定標(biāo)品進(jìn)行定標(biāo)，以下逐級(jí)對(duì)企業(yè)二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品、定標(biāo)儲(chǔ)備液、陽性參考品(質(zhì)控)進(jìn)行定標(biāo)。

2．9應(yīng)注意的其他問題

對(duì)于適用多個(gè)機(jī)型的產(chǎn)品，應(yīng)對(duì)所有型號(hào)儀器分別進(jìn)行性能評(píng)估。如適用于不同樣本類型，應(yīng)提交對(duì)不同樣本類型一致性的驗(yàn)證，包括不同抗凝齊、采血管的驗(yàn)證。

對(duì)試劑分析性能的充分驗(yàn)證是保證試劑臨床應(yīng)用靈敏、準(zhǔn)確、特異的前提，是了解試劑性能的必經(jīng)步驟，因此大量的試驗(yàn)、多批次的驗(yàn)證是必要的。對(duì)于不同試劑，其分析性能研究方法應(yīng)根據(jù)試劑本身特性進(jìn)行設(shè)計(jì)，本文闡述的乙肝核酸定量檢測(cè)試劑的性能評(píng)價(jià)應(yīng)首先考慮病毒本身的特性及試劑的臨床用途，因此定量是否靈敏、是否準(zhǔn)確精密、是否能夠涵蓋常見基因型、是否具備良好的特異性以及是否易被常見干擾物質(zhì)影響等方面成為其分析性能考察的重點(diǎn)。