制備培養(yǎng)基有什么要求？

東營(yíng)菌物科學(xué) 2019-09-21

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制備培養(yǎng)基要求

培養(yǎng)基制備的質(zhì)量將直接影響微生物生長(zhǎng)。因?yàn)楦鞣N微生物對(duì)其營(yíng)養(yǎng)要求不完全相同，培養(yǎng)目的的不同，各種培養(yǎng)基制備要求如下：

1、根據(jù)培養(yǎng)基配方的成分按量稱(chēng)取，然后溶于蒸餾水中，在使用前對(duì)應(yīng)用的試劑藥品應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。

2、PH 測(cè)定及調(diào)節(jié)：PH測(cè)定要在培養(yǎng)基冷至室溫時(shí)進(jìn)行，因在熱或冷的情況下，其PH有一定差異，當(dāng)測(cè)定好時(shí)，按計(jì)算量加入堿或酸混勻后，應(yīng)再測(cè)試一次。培養(yǎng)基 PH值一定要準(zhǔn)確，否則會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)或影響結(jié)果的觀察。但需注意因高壓滅菌可影響一些培養(yǎng)基的 PH 降低或升高，故不宜滅菌壓力過(guò)高或次數(shù)太多，以免影響培養(yǎng)基的質(zhì)量，指示劑、去氧膽酸鈉、瓊脂等一般在調(diào)完P(guān)H后再加入。

3、培養(yǎng)基需保持澄清，便于觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)基加熱煮沸后，可用脫脂棉花或絨布過(guò)濾，以除去沉淀物，必要時(shí)可用雞蛋白澄清處理，所用瓊脂條要預(yù)先洗凈晾干后使用，避免因瓊脂含雜質(zhì)而影響透明度。

4、盛裝培養(yǎng)基不宜用鐵、銅等容器，使用洗凈的中性硬質(zhì)玻璃容器為好。

5、培養(yǎng)基的滅菌既要達(dá)到完全滅菌目的，又要注意不因加熱而降低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，一般121℃15min即可，如為含有不耐高熱物質(zhì)的培養(yǎng)基如糖類(lèi)、血清、明膠等，則應(yīng)采用低溫滅菌或間歇法滅菌，一些不能加熱的試劑如亞碲酸鉀、卵黃、TTC、抗菌素等，待基礎(chǔ)瓊脂高壓滅菌后涼至50℃左右再加入。

6、每批培養(yǎng)基制備好后，應(yīng)做無(wú)菌生長(zhǎng)試驗(yàn)及所檢菌株生長(zhǎng)試驗(yàn)。如果是生化培養(yǎng)基，使用標(biāo)準(zhǔn)菌株接種培養(yǎng)，觀察生化反應(yīng)結(jié)果，應(yīng)呈正常反應(yīng)，培養(yǎng)基不應(yīng)貯存過(guò)久，必要時(shí)可置4℃冰箱存放。

7、目前各種干燥培養(yǎng)基較多，每批需用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行生長(zhǎng)試驗(yàn)或生化反應(yīng)觀察，各種培養(yǎng)基用相應(yīng)菌株生長(zhǎng)試驗(yàn)良好后方可應(yīng)用，新購(gòu)進(jìn)的或存放過(guò)久的干燥培養(yǎng)基，在配制時(shí)也應(yīng)測(cè)PH，使用時(shí)需根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)用量和方法進(jìn)行。

8、每批制備的培養(yǎng)基所用化學(xué)試劑、滅菌情況及菌株生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果、制作人員等應(yīng)做好記錄，以備查詢(xún)。

培養(yǎng)基的化學(xué)滅菌法

化學(xué)滅菌法系指用化學(xué)藥品來(lái)殺滅微生物的方法。同一種化學(xué)藥品的低濃度時(shí)呈現(xiàn)抑菌作用，而在高濃度時(shí)則能起殺菌作用。其殺菌機(jī)理可能是：能使微生物蛋白質(zhì)變性死亡，或與酶系統(tǒng)結(jié)合影響代謝，或改變膜壁通透性使微生物死亡等。常用的方法有消毒劑消毒法和化學(xué)氣體滅菌法等。

（一）消毒劑消毒法

消毒是指殺死病原微生物的方法。但化學(xué)消毒劑大多僅能殺死微生物的繁殖體而不能殺死芽孢，能控制一定范圍的無(wú)菌狀態(tài)。可將消毒劑配成適宜濃度，采用噴淋、涂擦或浸泡等方法對(duì)物料、環(huán)境、器具等進(jìn)行消毒。常用的化學(xué)消毒劑有0.1%～0.2%苯扎溴銨溶液、3%～5%的酚或煤酚皂溶液、75%乙醇等。常用于物體表面滅菌。但要注意其濃度不要過(guò)高，以防止化學(xué)腐蝕作用。潔凈室的墻面、天花板、門(mén)窗、機(jī)器設(shè)備、儀器、操作臺(tái)、車(chē)、桌、椅等表面以及人體雙手（手套）在環(huán)境驗(yàn)證及日常生產(chǎn)時(shí)，應(yīng)定期清潔并用消毒劑噴灑，無(wú)菌室用的消毒劑必須在層流工作臺(tái)中，用0.22μm的濾膜過(guò)濾后方能使用。

（二）化學(xué)氣體滅菌法

系指利用化學(xué)藥品的氣體或產(chǎn)生的蒸汽進(jìn)行殺滅微生物的方法。

1.環(huán)氧乙烷滅菌法

環(huán)氧乙烷滅菌法是利用環(huán)氧乙烷氣體進(jìn)行殺菌的方法。它是一種傳統(tǒng)的滅菌方法，可應(yīng)用于工衣滅菌、不耐加熱滅菌的藥品、醫(yī)用器具、設(shè)施、設(shè)備等的滅菌。

環(huán)氧乙烷滅菌系統(tǒng)，主要有下列四項(xiàng)互相制約的重要因素影響滅菌效果：

1、溫度；2、濕度；3、氣體濃度；4、滅菌時(shí)間。

因?yàn)榄h(huán)氧乙烷是易燃易爆物質(zhì)，明火可以引起燃燒，同時(shí)由于氣體分解還可能引起爆炸，環(huán)氧乙烷滅菌中應(yīng)十分注意安全問(wèn)題。

2.甲醛等蒸汽熏蒸法

采用甲醛、丙二醇或過(guò)氧醋酸等化學(xué)品，通過(guò)加熱產(chǎn)生蒸汽進(jìn)行空氣環(huán)境滅菌。

(1)、計(jì)算房間體積，按10g/m3的比例稱(chēng)出甲醛。

(2)、將甲醛倒入甲醛發(fā)生器或加熱盤(pán)或燒杯中，并放好加濕用水，必要時(shí)還需加入高錳酸鉀（2~3g/m3），然后加熱（甲醛發(fā)生器用蒸汽加熱，加熱盤(pán)或燒杯用熱水盛入其中加熱）使其蒸發(fā)成氣體。

(3)、滅菌流程：空調(diào)器停止運(yùn)轉(zhuǎn)→啟動(dòng)甲醛氣體發(fā)生器或在加熱盤(pán)中加熱甲醛 →讓甲醛氣體擴(kuò)散約30分鐘→啟動(dòng)空調(diào)器讓甲醛氣體循環(huán)約30分鐘→停止空調(diào)器，房間熏蒸消毒，時(shí)間不少于8小時(shí)→ 房間排氣，用新鮮空氣置換約2小時(shí)→ 恢復(fù)正常運(yùn)行。

當(dāng)相對(duì)濕度在65%以上，溫度在24~40℃時(shí)，甲醛氣體的消毒效果最好。

3、臭氧消毒法

臭氧（O3）的消毒原理是：臭氧在常溫、常壓下分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，很快自行分解成氧（O2）和單個(gè)氧原子（O），后者具有很強(qiáng)的活性，對(duì)細(xì)菌有極強(qiáng)的氧化作用，臭氧氧化分解了細(xì)菌內(nèi)部氧化葡萄糖所必須的酶，從而破壞其細(xì)胞膜，將其殺死。多余的氧原子則會(huì)自行重新結(jié)合成為普遍氧分子（O2），不存在任何有害殘留物，故稱(chēng)為無(wú)污染消毒劑。它不但對(duì)種種細(xì)菌（包括肝炎病毒、大腸桿菌、綠膿桿菌及雜菌等）有極強(qiáng)的殺滅能力，而且對(duì)霉菌也很有效。

培養(yǎng)基的物理滅菌方法

（一）加熱滅菌法

加熱可破壞微生物中酶、蛋白質(zhì)和核酸，導(dǎo)致微生物死亡。加熱滅菌又分干熱滅菌法和濕熱滅菌法。在同一溫度下，濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好。主要是因濕熱滅菌時(shí)，有水分存在，蛋白質(zhì)容易變性。水分又易使微生物膜壁潤(rùn)濕，濕熱的穿透力比干熱大。常用的有火焰滅菌法與干熱空氣滅菌法兩種。

（二）紫外線滅菌法

是指用紫外線照射殺滅微生物的方法。一般用于滅菌的紫外線波長(zhǎng)是200~300nm，滅菌力最強(qiáng)的波長(zhǎng)是253.7nm。紫外線作用于核酸蛋白促使其變性，同時(shí)空氣受紫外線照射后產(chǎn)生微量臭氧，從而起共同殺菌作用。紫外線進(jìn)行直線傳播，可被不同的表面反射，穿透力微弱，但較易穿透清潔空氣及純凈的水。因此本法適用于照射物體表面之滅菌、無(wú)菌室的空氣及水的滅菌；不適用于藥液的滅菌、固體物質(zhì)深部的滅菌；普通玻璃可吸收紫外線，因此裝于玻璃容器中的藥物不能用此法滅菌。紫外線對(duì)人體照射過(guò)久，會(huì)發(fā)生結(jié)膜炎，紅斑及皮膚燒灼等現(xiàn)象，故一般在人入室前開(kāi)啟紫外線燈1~2小時(shí)，關(guān)閉后人才進(jìn)入潔凈室。如果必須在人進(jìn)去后仍要開(kāi)紫外線滅菌，則人的皮膚及眼睛應(yīng)有有效的防護(hù)措施。一般在6~15m3的空間可裝置30瓦紫外線燈一盞，離地面2.5~3m為宜。

用紫外線照射滅菌時(shí)要注意下列問(wèn)題：

1、紫外線的殺菌力，隨使用時(shí)間增加而減退，一般使用時(shí)間達(dá)到額定時(shí)間70%時(shí)應(yīng)更換紫外線燈管，以保證殺菌效果。國(guó)產(chǎn)紫外線燈平均壽命一般為2000h。

2、紫外線的殺菌作用隨菌種不同而不同，殺霉菌的照射量要比殺桿菌大40~50倍。

3、紫外線照射通常按相對(duì)濕度為60%的基礎(chǔ)設(shè)計(jì)，室內(nèi)濕度增加時(shí)，照射量應(yīng)相應(yīng)增加。

4、紫外線滅菌效果與照射的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，這需要通過(guò)驗(yàn)證來(lái)確定照射時(shí)間。

5、紫外照射燈的安裝形式及高度，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況,參考使用說(shuō)明決定。

滅菌方法的驗(yàn)證采用生物指示劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)，生物指示劑多用枯草芽孢桿菌。

（三）微波滅菌法

微波是指頻率在30~3000MHz之間的電磁波。水可強(qiáng)烈地吸收微波，使其極性分子轉(zhuǎn)動(dòng)，分子間的磨擦而生熱，且升溫迅速，靠熱力而滅菌。在數(shù)十秒至幾分鐘之內(nèi)可達(dá)100～150℃，并全部殺死液體中的微生物，適于水溶性注射液的滅菌。另外，固體藥材飲片及固體制劑（丸劑、散劑、膠囊粉等）也含少量水分，微波能穿透到固體內(nèi)部，由表至里被均勻加熱，而起干燥、滅菌的作用。多用于口服液體制劑的滅菌，有望用于注射液的滅菌。但可能對(duì)某些藥品的PH值、含量、顏色有影響。

（四）輻射滅菌法

輻射滅菌是應(yīng)用γ射線、β射線殺滅細(xì)菌的方法，又稱(chēng)電離輻射，前者由鈷-60或銫-137發(fā)出，穿透力強(qiáng)；后者由電子加速器產(chǎn)生，帶電荷，穿透力弱，滅菌效果差。

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