解密||在現(xiàn)場(chǎng)擴(kuò)培中“菌膜”和“pH”是判斷發(fā)酵成功的關(guān)鍵因素嗎？

tssenpujgg 2019-12-08

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乳酸菌、EM菌等液體產(chǎn)品普遍存在運(yùn)輸成本高、菌量衰減較快等問(wèn)題，鑒于乳酸菌易擴(kuò)培和降低使用成本兩方面考慮，近兩年水產(chǎn)動(dòng)保公司紛紛推出了現(xiàn)場(chǎng)擴(kuò)培用菌包（粉劑為主），根據(jù)產(chǎn)品含量和溫度不同，養(yǎng)殖戶在現(xiàn)場(chǎng)采用簡(jiǎn)易裝置進(jìn)行密封發(fā)酵1-3天，獲得數(shù)百倍體積的乳酸菌或復(fù)合菌產(chǎn)品，使用面積擴(kuò)大數(shù)十倍，在實(shí)踐中獲得了良好的推廣。但因養(yǎng)殖戶無(wú)法直接檢測(cè)活菌含量，基本通過(guò)pH試紙測(cè)定發(fā)酵液pH、觀察上層菌膜、嗅氣味等感官指標(biāo)判斷發(fā)酵是否成功（部分可采用顯微鏡簡(jiǎn)單觀察菌的數(shù)量），但非生物類(lèi)專(zhuān)業(yè)人士對(duì)菌膜、氣味等蘊(yùn)含的真諦很難接觸到。本文就菌包中酵母菌含量及配套培養(yǎng)基配方對(duì)擴(kuò)培外觀、pH和菌量的影響進(jìn)行了對(duì)比，幫助養(yǎng)殖戶更好的評(píng)價(jià)發(fā)酵指標(biāo)進(jìn)而更深入得了解此類(lèi)產(chǎn)品。

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材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

菌包和培養(yǎng)基、北京陸橋MRS培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基、雷磁pH計(jì)、博迅隔水式恒溫培養(yǎng)箱、10L帶蓋小白桶等實(shí)驗(yàn)用品由青島根源生物集團(tuán)技術(shù)支持中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將菌包、培養(yǎng)基、曝氣后潔凈的自來(lái)水按1kg:1kg:100L稱(chēng)量后放于小白桶內(nèi)，混合均勻、加蓋后，室溫25-26℃發(fā)酵48h。在發(fā)酵初期、24h和48h采用pH計(jì)測(cè)定菌液pH，并在發(fā)酵結(jié)束后觀察菌膜情況、測(cè)定乳酸菌含量。乳酸菌計(jì)數(shù)采用十倍梯度稀釋法稀釋?zhuān)『线m梯度用MRS培養(yǎng)基傾注后，37℃培養(yǎng)48h，每毫升發(fā)酵液活菌數(shù)（CFU）=平板菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)。

實(shí)驗(yàn)首先選擇在同一培養(yǎng)基中，比較菌包中添加不同含量酵母菌對(duì)發(fā)酵的影響，酵母菌添加量分別設(shè)置：5.0×10⁵CFU/g、1.5×10⁶ CFU/g、2.5×10⁶ CFU/g、5.0×10⁶ CFU/g、1.0×10⁷ CFU/g。

然后在同一菌包配方下比較不同培養(yǎng)基配方對(duì)發(fā)酵的影響，配方分別為：配方1主要由葡萄糖、蔗糖和淀粉等組成；配方2主要由紅糖組成；配方3主要由葡萄糖、玉米漿干粉和豆粕等組成；配方4由豆粕、紅糖和玉米皮粉等組成。

結(jié)果與分析

2.1 菌包中酵母菌含量對(duì)發(fā)酵的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同酵母菌添加量初始pH值均為6.01左右，發(fā)酵24h后降低到3.5以下，48h后降低到3.0左右，不同添加量之間pH無(wú)顯著差異（P＞0.05）。發(fā)酵48h后各組乳酸菌菌量差異顯著（P＜0.05），其中配方中添加1.5×10⁶ CFU/g和2.5×10⁶ CFU/g的酵母菌組發(fā)酵菌量最高，隨著酵母添加量的增加發(fā)酵后乳酸菌菌量降低。

表1 不同酵母菌添加量對(duì)發(fā)酵pH和乳酸菌菌量影響

同一培養(yǎng)基下，菌包中酵母菌含量直接影響發(fā)酵后外觀，5.0×10⁶ CFU/g時(shí)，發(fā)酵后表面有一層厚厚的白膜，隨酵母菌添加量的增加，膜厚度變薄，增加至2.5×10⁶ CFU/g時(shí)，發(fā)酵后白膜厚度適中且表面有微量氣泡，繼續(xù)增加酵母用量，發(fā)酵表面氣泡增加、白膜變薄（圖1）

圖1 不同酵母添加量發(fā)酵48h外觀差異

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵的影響

實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)驗(yàn)中不同培養(yǎng)基組初始pH有一定差異，由配方原料pH不同引起，整體pH在6-6.5之間。發(fā)酵48h后各組間pH有顯著差異（P＜0.05），配方1最低，達(dá)到3.06，初始pH最低的配方4發(fā)酵后pH卻最高，為4.35（圖2）。

發(fā)酵48h后4種配方的乳酸菌含量有顯著差異（P＜0.05），配方4乳酸菌含量最高，達(dá)到10.6億/mL，比僅由紅糖組成的配方2菌量高7倍（圖3）,因此并非發(fā)酵后pH越低菌量越高，乳酸菌利用糖作為碳源發(fā)酵可產(chǎn)生乳酸、醋酸等有機(jī)酸，使發(fā)酵液pH降低，但隨著 pH 值下降，乳酸菌的活力及繁殖受到反饋抑制，限制了菌量繼續(xù)提升。

圖2 菌包在不同培養(yǎng)基中發(fā)酵后pH比較

圖3 菌包在不同培養(yǎng)基中發(fā)酵后乳酸菌比較

對(duì)發(fā)酵后上層菌膜進(jìn)行觀察顯示，不同培養(yǎng)基發(fā)酵后外觀差異很大，用配方1發(fā)酵后有薄膜，用純紅糖發(fā)酵后僅有氣泡無(wú)膜（配方2），而用豆粕等有機(jī)原料發(fā)酵的配方3和4有膜但厚薄不一（圖3、圖4）。通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，白膜中主要是酵母菌，發(fā)酵液中則乳酸菌為主，有少量酵母（圖5）。白膜主要是酵母菌少量繁殖產(chǎn)氣后與部分小顆粒有機(jī)載體在發(fā)酵過(guò)程中上浮形成一層膜，乳酸菌是兼性厭氧菌，自然放置時(shí)主要在水體中下層，在上層膜中占比很少。

圖4 不同培養(yǎng)基發(fā)酵外觀差異

圖5-1 白膜鏡檢 5-2發(fā)酵液鏡檢

3 討論

市場(chǎng)動(dòng)保產(chǎn)品魚(yú)龍混雜，乳酸菌類(lèi)產(chǎn)品擴(kuò)培看似簡(jiǎn)單、門(mén)檻低，且市場(chǎng)需求量大，造成市場(chǎng)產(chǎn)品種類(lèi)繁雜，多見(jiàn)廠家提供發(fā)酵菌包，養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)自配紅糖進(jìn)行發(fā)酵。因現(xiàn)場(chǎng)條件有限只能通過(guò)觀察白膜、采用試紙測(cè)定pH和聞酸香味的方法簡(jiǎn)單判斷發(fā)酵是否成功，但白膜到底是什么、pH低到多少最好，分辨這些有一定難度。

如菌包中不添加酵母僅添加乳酸菌時(shí)，因乳酸菌喜好在水體中下層厭氧環(huán)境生長(zhǎng)，發(fā)酵后菌液上層不產(chǎn)生菌膜。而菌包中添加酵母的情況下，菌膜情況因酵母添加量和培養(yǎng)基成分有所不同，采用紅糖做培養(yǎng)基，可觀察到酵母產(chǎn)生的氣泡，因紅糖可溶性較好表面不會(huì)形成白膜。使用不溶性有機(jī)物如豆粕等做培養(yǎng)基，酵母菌添加偏少時(shí)，稍有氣泡產(chǎn)生，則底層有機(jī)物大量上浮，白膜較厚；酵母菌添加過(guò)多時(shí)，氣泡豐富，氣泡翻騰攪動(dòng)水體，微細(xì)有機(jī)物顆粒難以浮在菌液表面，因此表面也無(wú)白膜。現(xiàn)場(chǎng)發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生白膜只是一種特定發(fā)酵條件下的現(xiàn)象，不是發(fā)酵成功和發(fā)酵深度的判定標(biāo)準(zhǔn)。

現(xiàn)場(chǎng)發(fā)酵因水溫條件、培養(yǎng)基添加量等添加限制，擴(kuò)培后菌量在1~5億CFU/mL，過(guò)程中乳酸菌繁殖10倍左右，當(dāng)然發(fā)酵水平顯著低于規(guī)范的發(fā)酵罐中菌量（幾十~一百億/mL），但對(duì)養(yǎng)殖戶來(lái)說(shuō)，有效濃度擴(kuò)增10倍會(huì)顯著降低使用成本，非常值得推薦。在這同時(shí)，需要辯證得看待發(fā)酵成功的標(biāo)準(zhǔn)，以及菌種和培養(yǎng)基成本。pH不是越低越好，這與菌種有關(guān)，菌膜不是發(fā)酵成功的必要條件，此外因菌的發(fā)酵需要營(yíng)養(yǎng)平衡，單純的以某一種原料比如紅糖做培養(yǎng)基，發(fā)酵后pH較低，但菌量明顯不足，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵后乳酸菌菌量為1.5億CFU/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它同時(shí)復(fù)配多種碳源和氮源的各組。養(yǎng)殖戶在實(shí)際擴(kuò)培時(shí)應(yīng)避開(kāi)宣傳陷阱，慎重選擇發(fā)酵產(chǎn)品和應(yīng)用方法。

作者：劉寶同

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