你的單抗雜交瘤細胞株產(chǎn)不出抗體，不妨試試基因工程抗體

基因工程抗體的概念比較廣

本文僅僅討論怎么從雜交瘤細胞株開始做基因工程抗體

主要解決如下幾個問題：

1.    知識產(chǎn)權保護的需要，給細胞株建立指紋身份；

2.    更容易發(fā)文章；

3.    序列比細胞株更容易保存；

4.    對于不容易從腹水或者培養(yǎng)制備抗體的細胞株換個思路

5.    人源化抗體的需求

6.    嵌合抗體潛在需要

從雜交瘤細胞株做單克隆抗體，主要解決分三大步驟：

1.    雜交瘤細胞株測序

測序的方法主要有兩種，

1)兼并引物設計（degenerate primer）分別擴增抗體重連和輕鏈的可變區(qū)

2)RACE法，RACE即cDNA末端快速擴增技術( rapid amplification of cDNA ends),是一種基于逆轉錄PCR從樣本中快速擴增cDNA的5′端及3'端的技術

方法1）更加的節(jié)約成本，便捷高效；但是很多的實驗室不掌握核心的兼并引物設計方法，只能選擇RACE方法。

2.    載體構建

分別構建重鏈和輕鏈的表達質粒，表達載體的選擇和元件優(yōu)化組合尤為重要，除了大家認為密碼子優(yōu)化問題，還有載體的信號肽選擇尤為重要，這個決定抗體的表達水平，一般優(yōu)先選擇V5信號肽，當抗體產(chǎn)量不高的時候也可以試試其他的信號肽，篩選最優(yōu)；當然載體的抗體的骨架選擇也是需要注意的。

3.    共轉染哺乳動物細胞表達

抗體的表達一般選用HKE293或者CHO細胞系，好用的細胞系一般都是商業(yè)化公司壓箱底至寶，不會輕易流出，其配套的轉染試劑和培養(yǎng)基也是經(jīng)過特殊優(yōu)化的，培養(yǎng)基和轉染試劑是可以公開出售的。

進行以上實驗，必須要1.2.0*10^6以上的雜交瘤細胞，越純越好；雜交瘤細胞株測序的難點在于基于PCR的引物對的設計，很多實驗室沒有這個技術，按照文獻發(fā)表的序列重復，往往也效果不好；這個時候可以委托專業(yè)化公司幫忙。

基因工程表達抗體的益處：

長期做單抗的實驗室都知道，經(jīng)常遇到雜交瘤細胞株產(chǎn)生抗體能力越來越弱或者抗體效價越來越低，主要原因可能是抗體基因發(fā)生突變，因此早期測序留住抗體基因尤為重要，對于規(guī)模化生產(chǎn)單抗的均一性更為重要。

現(xiàn)在很多的公司或者實驗室推出所謂的抗體氨基酸測序，目前這個技術不是很成熟，相對于抗體基因測序也不夠精確?？贵w氨基酸測序一般是把抗體的重鏈和輕鏈去糖基化，再用蛋白酶切斷，通過質譜鑒定，然后計算機拼接，這里面的難點：1.算法不一定科學；2.質譜鑒定中區(qū)分亮氨酸/異亮氨酸相對困難。