HBV感染可引起慢性乙型肝炎（CHB）、肝纖維化、肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌等終末期肝病，嚴重威脅著人類健康。HBV 感染呈世界性流行，全球約有 2.4 億慢性HBV感染者。在我國，預防性乙型肝炎疫苗的廣泛接種使新發(fā)感染率明顯下降，然而我國仍然是 HBV 感染的中高流行區(qū)。據推算，2016 年我國一般人群HBsAg陽性率為6.1%（95%可信區(qū)間:5.5%~6.9%），HBsAg陽性人群約 8600.7 萬。

HBV 屬于嗜肝DNA病毒科，其通過HBsAg的 pre-S1 區(qū)與肝細胞膜上的受體-鈉離子/?；悄懰峁厕D運多肽（NTCP）結合進入肝細胞。隨后，核衣殼在細胞質內裂解并將部分雙鏈的松散環(huán)狀 DNA（rcDNA）釋放入細胞核內，并通過宿主DNA聚合酶和拓撲酶等修補DNA 雙鏈缺口，形成共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）。隨后，以 cccDNA 為模板，分別轉錄出 3.5 kb 的前基因組 RNA（pgRNA）和preC mRNA，以及 2.4 kb、2.1 kb和0.7 kb 的 mRNA，轉錄本在細胞質內翻譯形成相應蛋白。翻譯形成的P蛋白與 pgRNA 結合后招募core蛋白，并組裝成病毒核衣殼。pgRNA在核衣殼內逆轉錄形成HBV DNA負鏈，再以負鏈為模板合成HBV DNA正鏈，形成病毒核心顆粒。最終，病毒核心顆粒經多囊泡小體包膜化并以病毒顆粒形式釋放至細胞外。此外，合成的含有rcDNA的病毒核心顆粒也可進入細胞核補充 cccDNA 池，使得HBV cccDNA 在肝細胞核內維持 5~50 拷貝/細胞。雖然 CHB 患者中 cccDNA 通常只占肝內 HBV DNA 總量的很少一部分，但其半衰期長，可穩(wěn)定存在于肝細胞核內，是 HBV 持續(xù)感染難以清除的重要原因。

目前臨床上治療CHB的抗病毒藥物為核苷（酸）類藥物（NAs） 和IFN。NAs 主要通過抑制P蛋白的逆轉錄活性，并與內源性核苷競爭性摻入病毒的 DNA 鏈，終止 DNA 鏈的延長和合成，從而抑制病毒的復制。NAs 可有效抑制病毒復制并延緩疾病進程，但由于其不直接作用于cccDNA，停藥后易復發(fā)，需要長期用藥，進而存在依從性、耐藥，以及經濟和心理壓力等一系列問題。IFN 具有免疫調節(jié)作用和抑制病毒基因轉錄的雙重作用，但由于其存在一定的副作用，療程有限，仍難以徹底清除HBV。由此可見，目前的抗病毒治療很難實現(xiàn)CHB的臨床治愈。究其原因，cccDNA的持續(xù)存在是CHB患者接受抗病毒治療后難以實現(xiàn)臨床治愈的重要因素。因此，研發(fā)靶向HBV cccDNA的藥物至關重要。本文將針對靶向HBV cccDNA的藥物和生物技術的研究進展作一綜述。

1  靶向cccDNA的基因編輯技術

目前，靶向cccDNA的常用基因編輯技術包括鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALEN）和成簇規(guī)律間隔短回文重復序列（CRISPR）/CRISPR相關（Cas）蛋白9 （CRISPR/Cas9）技術。

1.1  靶向cccDNA的ZFN技術

2010年，Cradick等首次證實ZFN可靶向切割HBV DNA基因組，使HBV pgRNA水平降低29％。2014年，Weber等針對HBV基因組P、C和X區(qū)開放閱讀框設計了3個ZFN，并利用腺相關病毒載體遞呈HBV特異性ZFN，測試其在HepAD38細胞中的抗HBV活性。結果表明，ZFN通過誘導靶位點堿基突變有效地破壞HBV基因組，其中腺相關病毒遞送的靶向P區(qū)開放閱讀框的ZFN可高效抑制HepAD38細胞中HBV復制，并持續(xù)至少2周。上述通過ZFN技術靶向破壞HBV基因組的研究證實了將基因編輯技術應用于抗病毒治療的可能性。

1.2  靶向cccDNA的TALEN技術

Bloom等設計了針對HBV基因組的TALEN，并證實TALEN可誘導cccDNA靶位點發(fā)生突變，首次證明了TALEN技術通過破壞HBV cccDNA有效抑制HBV復制。2014年，該團隊進一步將TALEN與DNA同源重組技術相結合，其首先通過靶向HBV基因組的TALEN切割HBV DNA，隨后，將人工設計的靶向HBV的初級microRNA(pri-miR)序列作為供體序列，通過DNA同源重組整合至病毒基因組中。一方面，該pri-miR序列能在病毒啟動子的作用下轉錄形成靶向HBV的miRNA從而抑制病毒復制，另一方面，由于插入pri-miR序列導致的錯義突變將進一步破壞病毒基因，進而協(xié)同抑制HBV復制。TALEN技術的應用為基因編輯技術通過靶向破壞HBV cccDNA抑制病毒復制提供了新的思路。

1.3  靶向cccDNA的CRISPR技術

CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過單鏈導向RNA（gRNA）和Cas9蛋白指導基因編輯。與ZFN和TALEN相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)設計及操作更為簡單，這使其得到了廣泛的應用。2014年，Lin等設計了8條靶向HBV的gRNA，并證實通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)可靶向切割HBV基因組，并顯著抑制HBV復制。Wang等發(fā)現(xiàn)與單個gRNA相比，雙gRNA介導的CRISPR/Cas9系統(tǒng)可通過去除切割位點之間的片段來更大程度地破壞HBV基因組，從而更為高效地抑制HBV復制。2017年，Wang等進一步通過gRNA-miR-HBV-gRNA 三聯(lián)表達框架將CRISPR/Cas9和RNAi技術整合，借助miRNA 在細胞內的加工過程最終產生兩個靶向HBV的 gRNA和一個靶向HBV的miRNA（miR-HBV），二者協(xié)同降低細胞內 cccDNA 水平，促進HBV清除。除了直接靶向cccDNA外，由于cccDNA的形成需要宿主因素的參與，還可通過靶向宿主基因從而影響cccDNA的合成。最近的一項研究報道，聚合酶κ是在新發(fā)HBV感染期間cccDNA形成所需的關鍵宿主因子。使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲減HepG2-NTCP細胞中聚合酶κ基因表達可顯著抑制rcDNA向cccDNA轉化，降低cccDNA水平。隨著CRISPR技術的發(fā)展和對HBV復制周期認識的加深，具有更高編輯效率和更低脫靶率的CRISPR系統(tǒng)也有望用于抗病毒研究與治療中。除了上述3種常見的基因編輯工具外，另有報道稱在體外使用靶向HBV cccDNA的ARC核酸酶可顯著破壞cccDNA和整合到人體肝細胞中的HBV DNA。

（詳細內容請參考網址http:///gilead-sciences-and-precision-biosciences-announce-collaboration-to-develop-therapies-against-hepatitis-b-virus-using-arcus-genome-editing/）

然而，目前基因編輯技術潛在的脫靶效應以及缺乏合適的體內遞呈載體限制了其在臨床上的使用，通過基因編輯技術靶向cccDNA仍有待進一步開發(fā)與優(yōu)化。

2  表觀遺傳學修飾靶向靜默cccDNA

表觀遺傳學修飾，即DNA甲基化和組蛋白修飾等。多項研究已證實表觀遺傳學修飾可調控HBV cccDNA轉錄，進而影響HBV復制。

2.1  靶向 cccDNA的DNA甲基化修飾

HBV基因組包含3個主要的CpG島，并且cccDNA的微染色體結構受DNA甲基化的表觀遺傳學調控。Zhang等分析了cccDNA中CpG島甲基化的分布，并研究了CpG島甲基化對病毒復制的影響，結果表明CpG島Ⅱ的甲基化可顯著降低cccDNA的轉錄水平，提示改變HBV cccDNA的甲基化狀態(tài)可作為一種潛在的實現(xiàn)功能性治愈的手段。

2.2  靶向cccDNA的組蛋白修飾

2006年，Pollicino等發(fā)現(xiàn)與cccDNA結合的H3/H4組蛋白乙?；癄顟B(tài)可調節(jié)HBV復制。組蛋白去乙?；?可募集到cccDNA上導致組蛋白去乙?；⒁种艸BV復制。I類組蛋白去乙?；敢种苿┛缮险{H4組蛋白乙酰化，并促進HBV復制。Liu等發(fā)現(xiàn)IFNα可通過降低H3組蛋白賴氨酸(H3K）9和H3K27的乙酰化水平抑制cccDNA轉錄。Zhang等發(fā)現(xiàn)蛋白質精氨酸甲基轉移酶5可通過促進cccDNA上H4組蛋白精氨酸3的對稱二甲基化抑制HBV core蛋白和基于Brg1的人SWI/SNF染色質重塑體的相互作用，進而抑制RNA聚合酶Ⅱ與cccDNA的結合。由此可見，通過調節(jié)cccDNA結合組蛋白乙酰化酶或去乙?；傅幕钚?，可作為抗HBV治療的靶點。

以上多項研究證實表觀遺傳學修飾對 HBV 的持續(xù)存在和清除起著重要作用，表明表觀遺傳治療具有治療CHB的潛力。此外，可以通過借鑒腫瘤和其他病毒性疾病的表觀遺傳治療，為CHB的治療開辟新途徑。

3  細胞因子靶向清除cccDNA

除了治療性疫苗之外，許多細胞因子可參與HBV感染的控制。Lucifora等發(fā)現(xiàn)高劑量IFNα處理能刺激APOBEC3A的表達，淋巴毒素β受體激活能刺激APOBEC3B的表達，二者可通過HBV core蛋白與cccDNA相互作用，導致胞苷脫氨基，脫嘌呤/脫嘧啶位點形成，從而導致cccDNA降解。Xia等發(fā)現(xiàn)IFNγ和TNFα能各自誘導cccDNA脫氨基并干擾其穩(wěn)定性，并證實HBV特異性T淋巴細胞不需要細胞溶解所需的直接接觸，而是通過分泌IFNγ和TNFα亦可抑制HBV復制并降低感染細胞中cccDNA水平。Bockmann等研究發(fā)現(xiàn)IFNβ和IFNλ能使肝細胞中HBV cccDNA通過脫氨基作用發(fā)生G-A序列改變。并且與IFNα相比，IFNβ和IFNλ誘導的APOBEC脫氨酶表達更為持久。Qiao等在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)TGFβ可通過肝細胞中激活誘導的胞苷脫氨酶誘導cccDNA脫氨基降解和突變。然而，有關細胞因子針對HBV cccDNA的抗病毒作用還有待進一步的研究。

4  靶向病毒蛋白負性調控cccDNA

病毒蛋白包括HBV X蛋白（HBx）和core蛋白在cccDNA的轉錄過程和維持cccDNA的穩(wěn)定性中都發(fā)揮著重要作用。因此，除了直接靶向HBV cccDNA外，通過靶向這些病毒蛋白也能實現(xiàn)對cccDNA的調控。

4.1  靶向HBx抑制cccDNA 轉錄

HBx能通過與宿主的損傷特異性DNA結合蛋白1（DDB1）結合從促進HBV復制。Decorsière等發(fā)現(xiàn)HBx通過降解染色體結構維持（Smc）復合物Smc5/6可緩解Smc5/6對HBV cccDNA轉錄的抑制作用。Murphy等進一步證明HBx與DDB1-CUL4-ROC1（CRL4）E3連接酶相互作用，泛素化降解Smc5/6，進而促進HBV復制?；诖?，Sekiba等發(fā)現(xiàn)一種噻唑化物抗感染劑硝唑尼特可有效抑制HBx-DDB1蛋白的相互作用，并在人原代肝細胞中證實硝唑尼特能夠恢復Smc5蛋白水平，進而抑制HBV cccDNA轉錄和病毒蛋白產生。

4.2  靶向core蛋白干擾cccDNA合成

NAs雖然并不直接作用于cccDNA，但卻通過抑制以前基因組RNA為模板逆轉錄合成rcDNA的過程，阻斷cccDNA的補充，因而被認為具有間接耗竭cccDNA的作用。然而，現(xiàn)有NAs并不能夠完全阻斷新rcDNA的合成。核衣殼裝配調節(jié)劑（CpAM）能變構調節(jié)core蛋白結構并隨后改變core蛋白組裝的動力學和途徑，導致形成不規(guī)則形狀的core蛋白聚集體或缺乏pgRNA和P蛋白的空衣殼。除了抑制核衣殼組裝和隨后的病毒基因組復制之外，CpAM還能改變核衣殼的結構和功能，并因此影響病毒DNA復制和（或）cccDNA補充。CpAM能誘導病毒粒子以及含有雙鏈DNA的核心顆粒發(fā)生解體，從而在新發(fā)感染和細胞內擴增過程中干擾cccDNA生物合成途徑。了解core蛋白質變構調節(jié)劑對核衣殼裝配和拆卸的雙重作用所依據的分子機制將有助于發(fā)現(xiàn)新的靶向core蛋白的抗病毒藥物，進而更加有效地抑制cccDNA合成和治療CHB。CpAM作為一種針對新靶點的抗病毒藥物，未來有望聯(lián)合其他抗病毒藥物共同清除HBV。

總之，現(xiàn)階段有多個靶向 HBV 生命周期各個階段的新型抗病毒藥物正在研發(fā)之中，其中靶向HBV cccDNA的治療策略被認為是最有可能清除 HBV 的手段，故被認為是HBV 新藥發(fā)展的重要方向。此外，結合免疫治療的多途徑、多靶點藥物聯(lián)合阻斷 HBV 的生物學合成并促進cccDNA清除將可能成為根治慢性 HBV 感染的重要途徑。但目前對 cccDNA 形成、維持及降解的生物學機制尚未完全闡明，相關基礎研究亟需加強。