 什么是組間差異檢驗？就是組間的差異分析以及顯著性檢驗，應(yīng)用統(tǒng)計學上的假設(shè)檢驗方法，檢驗組間是否有差異及其差異程度。坦率地講，所有的差異檢驗都基于一個假設(shè)：組間沒有差異，變量之間沒有關(guān)系（即原假設(shè)， 參數(shù)與非參數(shù)檢驗所以，本著負責的態(tài)度，在本文的開始我們有必要回顧一下《概率論與數(shù)理統(tǒng)計》中關(guān)于假設(shè)檢驗的基本概念。
其中參數(shù)這個概念最值得我們好好體會，因為今天的主角組間差異檢驗，在這個水平上可以分為兩類：參數(shù)檢驗和非參數(shù)檢驗。那么什么叫參數(shù)檢驗和非參數(shù)檢驗，它們之間的區(qū)別是什么呢。要理解前面的問題，首先需要明白統(tǒng)計推斷的概念。 統(tǒng)計推斷是研究如何利用樣本數(shù)據(jù)來推斷總體特征的統(tǒng)計學方法，包括參數(shù)估計和假設(shè)檢驗兩大類。總體的參數(shù)一般是未知的，通?？梢杂脴颖窘y(tǒng)計量來對總體的參數(shù)進行估計，例如可以用樣本均值對總體均值進行點估計，利用樣本均值的分布對總體均值進行區(qū)間估計，這些都稱為參數(shù)估計。
參數(shù)檢驗和非參數(shù)檢驗的區(qū)別：
那么什么時候用參數(shù)檢驗，什么時候用非參數(shù)檢驗?zāi)兀糠菂?shù)檢驗一般不直接用樣本觀察值作分析，統(tǒng)計量的計算基于原始數(shù)據(jù)在整個樣本中的秩次，丟棄了觀察值的具體數(shù)值，因此凡適合參數(shù)檢驗的資料，應(yīng)首選參數(shù)檢驗。但是不清楚是否合適參數(shù)檢驗的資料，則應(yīng)采用非參數(shù)檢驗。 此處也許大家期待作者帶我們溫習一下假設(shè)檢驗的4 個步驟（提出假設(shè)；構(gòu)造檢驗統(tǒng)計量；根據(jù)顯著水平，確定臨界值和拒絕域；做出檢驗決策），但是帶有幾分傲氣的作者絕情地不為我們沒有學好的課程補刀，補課的事情讓我們自己去做，他轉(zhuǎn)而講自己認為重要的知識點：抽樣分布。 抽樣分布知道我們的研究對象整體處于什么狀態(tài)，是一件非常重要的事情。三大抽樣分布（ 離開分布，假設(shè)檢驗無從談起；離開假設(shè)檢驗，差異分析毫無根基。同樣地，出于人道主義，我們來重溫一下抽樣分布。
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| 類型 | R包 |
|---|---|
| 箱線圖 | geom_boxplot() {ggplot2} |
| 散點圖 | geom_point(){ggplot2} |
| 熱圖 | heatmap;pheatmap |
| 樹狀圖 | ggtree;cluster |
這里說的基于物種言下之意是通過統(tǒng)計分析，可以有針對性的找出分組間豐度變化差異顯著的物種，并得到差異物種在不同分組間的富集情況，同時，可以比較組內(nèi)差異和組間差異的大小，判斷不同分組間的群落結(jié)構(gòu)差異是否具有顯著意義。也就是說可以找出區(qū)別組間的一個biomarker。
這類檢驗一般只輸出p值，它的目的很簡單，就是檢驗比較組之間的相似性距離是否有差異。常用的分析方法有卡方檢驗、Student t檢驗、Wilcoxon秩和檢驗等等。
如果只有兩個樣本比較，適合用卡方檢驗，不過說實在的，檢驗出來的結(jié)果沒什么可靠性，因為現(xiàn)階段16s研究不做重復(fù)實在“難以服眾”了。先不說價格便宜，做重復(fù)壓根沒有難度，就是從生物學、統(tǒng)計學角度考慮，也需要做重復(fù)。
如果是兩組樣本（至少3重復(fù)），可以試一下Student t，Welch‘st以及Wilcoxon秩和檢驗。Student t檢驗需要樣本符合正態(tài)分布，而且方差對齊。當組間樣本數(shù)不同，方差也不對齊的時候，Welch’s t檢驗是很好的選擇。
Wilcoxon秩和檢驗又叫Mann-Whitney U 檢驗，是基于變量排名的一種統(tǒng)計方法，不需要樣本符合正態(tài)分布，也不需要樣本方差對齊，是更為廣泛的檢驗方法，但同時也由于檢驗太寬松，容易帶來很多假陽性。
如果是多組樣本比較，可以選擇one way ANOVA、TURKEY以及Kruskal-Wallis H檢驗等方法。one way ANOVA和TURKEY其實都是基于方差分析，只不過后者帶有后驗，可以知道兩個分組對整體差異的貢獻度。
Kruskal-Wallis H檢驗本質(zhì)也是一種秩和檢驗，與前兩者的區(qū)別在于，它不需要樣本數(shù)和方差的對齊，應(yīng)用更為廣泛。Kruskal-Wallis檢驗又被稱之為單因素非參數(shù)方差分析。
毫不客氣地講，一般秩和檢驗或置換檢驗屬于非參數(shù)檢驗。在這類差異檢驗中，有兩種集成方法特別值得我們注意：LEfSe 、metastats。
LEfSe （LDA EffectSize）
其實是一種判別分析。它通過生物學統(tǒng)計差異使其具有強大的識別功能。然后，它執(zhí)行額外的測試，以評估這些差異是否符合預(yù)期的生物學行為。具體來說，首先使用non-parametric factorial Kruskal-Wallis (KW) sum-rank test（非參數(shù)因子克魯斯卡爾—沃利斯和秩驗檢）檢測具有顯著豐度差異特征，并找到與豐度有顯著性差異的類群。最后，LEfSe采用線性判別分析（LDA）來估算每個組分（物種）豐度對差異效果影響的大小。
得到結(jié)果展示如下，差異體現(xiàn)在柱形圖和樹狀圖上。LDA值分布柱狀圖中展示了LDA Score大于設(shè)定值（默認設(shè)置為4）的物種，即組間具有統(tǒng)計學差異的Biomarker。展示了不同組中豐度差異顯著的物種，柱狀圖的長度代表差異物種的影響大?。礊?LDA Score）。
在進化分支圖中，由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門至屬（或種）的分類級別。在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類，小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比。著色原則：無顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色，差異物種Biomarker跟隨組進行著色，紅色節(jié)點表示在紅色組別中起到重要作用的微生物類群，綠色節(jié)點表示在綠色組別中起到重要作用的微生物類群，若圖中某一組缺失，則表明此組中并無差異顯著的物種，故此組缺失。圖中英文字母表示的物種名稱在右側(cè)圖例中進行展示。
metastats
核心在于針對不同的特征分為t檢驗和Fish exact檢驗，t檢驗通過permutation去估算分布模型，從而計算p值，計算好的p值，利用FDR去判斷存在顯著差異的界限值。此軟件主要針對兩組之間的比較，兼顧考慮了物種中分布廣泛的菌（t permutation的分析）和分布稀少的菌（卡方檢驗）。
）。上海交大王成老師也說方差分析其實研究的就是不同水平下是否有差異化的假設(shè)檢驗問題。而假設(shè)檢驗就是先對總體參數(shù)提出某種假設(shè)，然后利用樣本信息判斷假設(shè)是否成立的過程。
-分布、
分布、
-分布）和正態(tài)分布共同構(gòu)成了現(xiàn)代數(shù)理統(tǒng)計學的基礎(chǔ)，其中，正態(tài)分布和+ 將豐度數(shù)據(jù)歸一化成為相對豐度
+ 組間T-test計算
+ 顯著性檢驗
+ Permutation test 置換檢驗
+ 重復(fù)數(shù) ≥8與重復(fù)數(shù) <8的p值計算規(guī)則不同
+ 重復(fù)數(shù) ≥8：只開展單物種的置換檢驗
+重復(fù)數(shù) <8：將混合整個樣本進行置換檢驗
+ 組內(nèi)某個物種的數(shù)目少于樣本重復(fù)數(shù)的時候，會利用Fisher精確檢驗進行p值計算
+ 多重檢驗metastats結(jié)果給出差異物種的p值和q值（表中 的數(shù)據(jù)是假的?。?/p>
| Taxa | mean (group1) | variance (group1) | standard error (group1) | mean (group2) | variance (group2) | standard error (group2) | p value | q value |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Clostridia | 0.0045 | 3.3191e-06 | 0.077 | 0.03 | 4.37e-05 | 0.089 | 0.0025 | 0.0257 |
| Alphaproteobacteria; | 0.2445 | 0.0018 | 0.0062 | 0.1117 | 0.003 | 0.009 | 0.0598 | 0.03933 |
| Spirochaetia; | 0.0002 | 1.448e-08 | 5.949e-05 | 0.00146 | 1.10134e-07 | 0.00016 | 0.003 | 0.0141 |
| Nitrospira; | 0.059 | 0.009 | 0.008 | 0.0874 | 7.1501e-05 | 0.003 | 0.0054 | 0.0323 |
| Deltaproteobacteria; | 0.037 | 0.32 | 0.009 | 0.03454 | 1.58e-05 | 0.0016 | 0.01484 | 0.03733 |
| Acidimicrobiia; | 0.003 | 9.0e-06 | 0.001518 | 0.02 | 0.003431 | 0.00619 | 0.001 | 0.020 |
| Anaerolineae; | 0.03 | 5.015e-06 | 0.001 | 0.0416 | 9.1706e-05 | 0.0048 | 0.002 | 0.0244 |
| ---- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
所謂基于距離也就是檢驗的是群落差異而不是某個物種。上面所提及的檢驗方法，其實都只能告訴大家，這些分組是否有顯著差異（可以簡單理解為有無）。那如果想同時知道這些差異的程度（可以簡單理解為多少）呢，那需要Anosim，Adonis以及MRPP等檢驗方法。這些方法不但可以輸出檢驗顯著性結(jié)果（p值），還有程度結(jié)果（R值），R值可以用來判斷分組貢獻度大小。Anosim、Adonis這些可用于多元統(tǒng)計檢驗的模型就非常適合了。要值得注意的是，Anosim本質(zhì)是基于排名的算法，其實與NMDS的配合效果最好。如果是PCoA分析，建議配合使用Adonis檢驗結(jié)果。
Anosim
Anosim（Analysis of similarities）是一種非參數(shù)檢驗方法。它首先通過變量計算樣本間關(guān)系（或者說相似性），然后計算關(guān)系排名，最后通過排名進行置換檢驗判斷組間差異是否顯著不同于組內(nèi)差異。這個檢驗有兩個重要的數(shù)值，一個是p值，可以判斷這種組間與組內(nèi)的比較是否顯著；一個是R值，可以得出組間與組內(nèi)比較的差異程度。Anosim用來檢驗組間的差異是否顯著大于組內(nèi)差異，從而判斷分組是否有意義，Anosim分析使用R vegan包anosim函數(shù),一般基于Bray-Curtis距離值的秩次進行組間差異顯著行檢驗，詳細計算過程可查看Anosim。
Adonis
ADONIS又稱置換多因素方差分析（permutational MANOVA）或非參數(shù)多因素方差分析（nonparametric MANOVA），是一種基于Bray-Curtis距離的非參數(shù)多元方差分析方法。它與Anosim的用途其實差不多，也能夠給出不同分組因素對樣品差異的解釋度（R值）與分組顯著性（P值）。不同點是應(yīng)用的檢驗?zāi)Ｐ筒煌?，ADONIS本質(zhì)是基于F統(tǒng)計量的方差分析，所以很多細節(jié)與上述方差分析類似。該方法可分析不同分組因素對樣本差異的解釋度，并使用置換檢驗對分組的統(tǒng)計學意義進行顯著性分析。ADONIS分析使用R vegan包adonis函數(shù)進行分析，詳細計算過程可adonis
MRPP
MRPP分析與Anosim類似，但是MRPP是基于Bray-Curtis的參數(shù)檢驗，用于分析組間微生物群落結(jié)構(gòu)的差異是否顯著，通常配合PCA、PCoA、NMDS等降維圖使用，MRPP分析使用R vegan包mrpp函數(shù),詳細計算過程可查看MRPP
amova
分子方差分析法 (AMOVA)與ANOVA類似，是基于加權(quán)或非加權(quán)Unifrac距離矩陣，檢驗不同組間差異顯著性的非參數(shù)分析方法。一般基于Unifrac距離，使用mothur軟件amova函數(shù)進行組間差異分析，詳細計算過程可查看Amova
Mantel test
Mantel test，Mantel test 是對兩個矩陣相關(guān)關(guān)系的檢驗，顧名思義，是一種檢驗。既然是檢驗就得有原假設(shè)，它的原假設(shè)是兩個矩陣見沒有相關(guān)關(guān)系。檢驗過程如下：兩個矩陣都對應(yīng)展開，變量兩列，計算相關(guān)系數(shù)（理論上什么相關(guān)系數(shù)都可以計算，但常用pearson相關(guān)系數(shù)），然后其中一列或兩列同時置換，再計算一個值，permutation 成千上萬次，看實際的r值在所得r值分布中的位置，如果跟隨機置換得到的結(jié)果站隊較近，則不大相關(guān)，如果遠遠比隨機由此得到顯著性。詳細計算過程可查看Mantel test
| 方法 | R值 | p值 |
|---|---|---|
| Anosim | R-value介于（-1，1）之間，R-value大于0，說明組間差異顯著 | P< 0.05 表示統(tǒng)計具有顯著性 |
| Adonis | R2 表示不同分組對樣本差異的解釋度 | Pr表示P 值，小于0.05 說明本次檢驗的可信度高 |
| Amova | --- | p-value表示P 值，小于0.05 說明組間差異顯著 |
| MRPP | A值大于0說明組間差異大于組內(nèi)差異 | Significance值小于0.05說明差異顯著 |
| Mantel test | r為相關(guān)系數(shù)，r值越大兩矩陣相關(guān)性越大 | P<0.05表示統(tǒng)計具有顯著性 |
作者實在太懶，堅持別人已經(jīng)說過的話不愿再說，只要抄過來就好了，在文章的最后他把趙小胖的一段話原版搬了過來：
無論你從事何種領(lǐng)域的科學研究還是統(tǒng)計調(diào)查，顯著性檢驗作為判斷兩個乃至多個數(shù)據(jù)集之間是否存在差異的方法被廣泛應(yīng)用于各個科研領(lǐng)域。筆者作為科研界一名新人也曾經(jīng)在顯著性檢驗方面吃過許多苦頭。后來醉心于統(tǒng)計理論半載有余才摸到顯著性檢驗的皮毛，也為顯著性檢驗理論之精妙，品種之繁多，邏輯之嚴謹所折服。在此，特寫下這篇博文，以供那些仍然掙扎在顯著性檢驗?zāi)嗵兜姆墙y(tǒng)計專業(yè)的科研界同僚們參考。由于筆者本人也并非統(tǒng)計專業(yè)畢業(yè)，所持觀點粗陋淺鄙，貽笑大方之處還望諸位業(yè)界前輩，領(lǐng)域翹楚不吝賜教。小可在此謝過諸位看官了。
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