融合蛋白在分子生物學(xué)中的應(yīng)用極為廣泛，最簡(jiǎn)單的應(yīng)用是在蛋白質(zhì)的末端連上標(biāo)簽，用于WB檢測(cè)或純化。復(fù)雜一些的應(yīng)用則是將需要研究的目的蛋白與另一個(gè)標(biāo)記蛋白連接：當(dāng)標(biāo)記蛋白為熒光蛋白時(shí)，可將目的蛋白的示蹤和圖像學(xué)分析；標(biāo)記蛋白為白蛋白或者抗體Fc片段時(shí)，可用于延長(zhǎng)目的蛋白的半衰期；又或者將兩個(gè)目的蛋白連接，用于研究他們的共同功能或者相互作用。

作為需要使用融合蛋白的科研工作者，了解一些必要的Linker知識(shí)，將使得您在設(shè)計(jì)質(zhì)粒方面更加得心應(yīng)手。本文將介紹一下天然形式下的蛋白Linker和目前應(yīng)用最廣泛的人工合成Linker，以及他們的特性；其次介紹通過(guò)增加蛋白Linker實(shí)現(xiàn)的各種功能，包括提高折疊和穩(wěn)定性，促進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)，增加內(nèi)在生物學(xué)活性；最后介紹如何使用在線工具設(shè)計(jì)Linker。

我們通常將使用的蛋白Linker分為3種，分別為柔性Linker、剛性Linker以及可剪切（或自剪切）Linker。

柔性Linker

最常見(jiàn)的柔性Linker就是G（Gly）甘氨酸和S（Ser）絲氨酸的GS組合，最常用的GS組合就是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，通過(guò)改變n的大小，研究者可以將結(jié)構(gòu)域之間的距離放大和減小，實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)域分離（n≥2）或連接結(jié)構(gòu)域，研究其相互作用。

其他一些常見(jiàn)的蛋白Linker具有一些特定的用途，例如單鏈可變片段（single chain variable fragment (scFv)）中，連接重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）的柔性Linker，通常為KESGSVSSEQLAQFRSLD和 EGKSSGSGSESKST。這些序列中甘氨酸（Gly）和絲氨酸（Ser）提供柔軟度，谷氨酸（Glu）和賴氨酸（Lys）提高水溶性。

更簡(jiǎn)單粗暴一些的柔性Linker就是純甘氨酸（Gly）組成的(Gly)8，或短一點(diǎn)點(diǎn)的(Gly)6，它們的優(yōu)點(diǎn)是在酵母表達(dá)純化過(guò)程中，能夠抵抗蛋白酶的水解，同時(shí)保護(hù)兩端蛋白結(jié)構(gòu)域的功能活性。

剛性Linker

具有(EAAAK)n序列的α-螺旋形成的Linker具有內(nèi)部氫鍵和密切聯(lián)系肽鏈骨干，剛性且穩(wěn)定。因此，剛性α-螺旋Linker可作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間的剛性間隔。通過(guò)將藍(lán)色熒光蛋白（EBFP）和綠色熒光蛋白（EGFP）連接在一起，評(píng)估熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）之間的效率，可以發(fā)現(xiàn)(EAAAK)n序列連接兩個(gè)熒光蛋白時(shí)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率比(GGGGS)n序列低，說(shuō)明α-螺旋Linker能夠有效的隔離兩個(gè)不同的蛋白結(jié)構(gòu)域。

另一種類(lèi)型的剛性Linker具有Pro-rich序列(XP)n，其中X可指定任何氨基酸，推薦選擇丙氨酸（Ala），賴氨酸（Lys）或谷氨酸（Glu）。(XP)n序列沒(méi)有螺旋結(jié)構(gòu)，Linker中存在的脯氨酸（Pro）可以增加骨架硬度，并且有效分離結(jié)構(gòu)域。富含脯氨酸序列的結(jié)構(gòu)在機(jī)體中廣泛的存在，例如骨骼肌蛋白的N端就存在(Ala-Pro)7的結(jié)構(gòu)。

剛性Linker表現(xiàn)出相對(duì)堅(jiān)硬的結(jié)構(gòu)，能夠有效的將兩端的蛋白結(jié)構(gòu)域分開(kāi)，通過(guò)改變n的大小，就能夠輕易調(diào)整結(jié)構(gòu)域之間的最佳距離，從而保證兩端蛋白的活性與生物功能。

可剪切Linker

到目前為止討論的Linker通常不會(huì)在體內(nèi)裂解。這些穩(wěn)定的接頭共價(jià)連接兩個(gè)功能域，使得融合蛋白在體內(nèi)變成一個(gè)蛋白。功能結(jié)構(gòu)域之間的穩(wěn)定連接提供許多優(yōu)點(diǎn)，例如延長(zhǎng)的血漿半衰期（例如白蛋白或Fc融合）。然而，它也有一些潛在的缺點(diǎn)，包括功能域之間的空間位阻，生物活性降低，以及由于域之間的干擾導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分的生物分布和代謝方式改變。在這些情況下，引入可剪切Linker，使得融合蛋白能夠在體內(nèi)釋放，分離兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。

一個(gè)研究的比較透徹的過(guò)程是二硫鍵的還原。這個(gè)可剪切Linker序列為LEAGCKNFFPR↓SFTSCGSLE，基于二硫環(huán)肽，在接頭上的兩個(gè)半胱氨酸（Cys）殘基之間形成的分子內(nèi)二硫鍵，同時(shí)這個(gè)序列對(duì)凝血酶敏感。在凝血酶的作用下能夠有效的對(duì)Linker中凝血酶敏感序列（PRS）進(jìn)行切割。

其他比較流行的可剪切Linker，能夠不依賴蛋白酶，自行進(jìn)行切割處理，使得兩個(gè)結(jié)構(gòu)域斷裂。這些自剪切Linker通為2A短肽，通常在序列NPG↓P進(jìn)行自剪切分離。2A短肽通常來(lái)源于病毒的蛋白質(zhì)序列，例如P2A表示來(lái)源于豬捷申病毒（porcine teschovirus-1）；E2A表示來(lái)源于馬鼻炎病毒（equine rhinitis A virus）；F2A表示來(lái)源于口蹄疫病毒（Footand Mouth Disease Virus）。由于自剪切效率各有不同，2A短肽之間也存在一定差異，我們一般推薦使用P2A或T2A序列。

如何設(shè)計(jì)Linker

隨著對(duì)天然多結(jié)構(gòu)域蛋白中的Linker和重組融合蛋白的廣泛研究，研究者們萌生了構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)的想法，提出了Linker設(shè)計(jì)工具，基于融合蛋白的期望特性來(lái)合理設(shè)計(jì)Linker。這種類(lèi)型的工具的一個(gè)典型例子是名為synlinker的程序，該程序在用戶指定的輸入（例如Linker長(zhǎng)度，要避免的蛋白酶敏感序列）中搜索其連接子序列的數(shù)據(jù)庫(kù)，并生成幾個(gè)連接子序列的輸出。Linker數(shù)據(jù)庫(kù)是基于這樣的假設(shè)建立的，即在X射線晶體結(jié)構(gòu)或NMR溶液結(jié)構(gòu)中觀察到的環(huán)序列可能采用延伸構(gòu)象作為融合蛋白中的Linker。最終的數(shù)據(jù)庫(kù)包含14,734個(gè)序列，它們包含PDB文件中的記錄，可自動(dòng)識(shí)別蛋白質(zhì)的二級(jí)和環(huán)狀結(jié)構(gòu)。程序的基本輸入是Linker序列的期望長(zhǎng)度，通常表示為殘基數(shù)量或以埃為單位的距離。額外的輸入?yún)?shù)包括，避免被蛋白酶或限制性內(nèi)切酶切割，使得選擇的Linker在克隆過(guò)程中對(duì)特定蛋白酶穩(wěn)定或序列對(duì)限制性內(nèi)切酶具有抗性。使用者還可以加入氨基酸組成偏好（例如，消除疏水性殘基）以進(jìn)一步選擇其感興趣的Linker。此程序可以作為生成Linker序列的工具，使用十分便利（http://synlinker./）。

不過(guò)，如果您覺(jué)得設(shè)計(jì)Linker有些麻煩，構(gòu)建質(zhì)粒也無(wú)從下手，且耗時(shí)費(fèi)力，那么把這些工作交給專(zhuān)業(yè)的科研服務(wù)供應(yīng)商不失為一個(gè)便捷、高效的選擇。默賽爾生物公司專(zhuān)業(yè)提供質(zhì)粒構(gòu)建服務(wù)，協(xié)助您量身定制科研計(jì)劃。默賽爾生物公司憑借在分子生物學(xué)領(lǐng)域積累的豐富的工作經(jīng)驗(yàn)，可根據(jù)已有載體進(jìn)行各種改造方案的設(shè)計(jì)，我們的服務(wù)內(nèi)容有：

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2. 處理載體，進(jìn)行目的基因與載體的連接。

3. 轉(zhuǎn)化連接目的基因的載體，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)，鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒。

4. 對(duì)連接目的基因的載體進(jìn)行DNA測(cè)序。

5. 將陽(yáng)性質(zhì)粒保存菌種，質(zhì)粒和測(cè)序報(bào)告提交給客戶。

6. 針對(duì)客戶要求對(duì)現(xiàn)有質(zhì)粒結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。

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服務(wù)示例：

參考文獻(xiàn)

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