高質(zhì)量準(zhǔn)確性和低分辨率

對于高質(zhì)量準(zhǔn)確性的測量，低分辨率的四極桿質(zhì)譜儀表現(xiàn)性能良好，比如將其應(yīng)用到蛋白質(zhì)的分析中：當(dāng)同位素峰相對彼此，沒有被分辨出時(shí)，蛋白質(zhì)的質(zhì)量通常定義為"平均"值。平均質(zhì)量是分子中所有同位素離子的加權(quán)平均值。通常使用在四極桿質(zhì)譜儀上的儀器分辨率擴(kuò)大分辨響應(yīng)，對10kDa的蛋白，乘以1.27的因子。所乘因子隨質(zhì)量數(shù)增加而顯著增加（例如，100kDa乘以2.65）。不過，減小峰寬到m/z0.25（增加分辨率到4000），而不是將質(zhì)譜儀分辨率限制到1000，即使用峰寬m/z0.6，能顯著提高信號(hào)強(qiáng)度。實(shí)際工作中，大分子的ESI-MS分析能得到多電荷離子。因此，峰寬需要除以離子的電荷數(shù)，以得到在該質(zhì)荷比的峰寬。

例如，帶有10或20個(gè)電荷的20kDa蛋白質(zhì)將產(chǎn)生一個(gè)多同位素離子共存峰，在m/z大約為2000或1000，各自對應(yīng)的峰寬為0.9或0.45m/z單位。當(dāng)這些離子在質(zhì)譜儀上實(shí)測時(shí)，將分辨率設(shè)置得非常低，顯著低于分辨同位素所要求的分辨率（分辨率低于10000），對每個(gè)帶電狀態(tài)，將得到單一的峰。由單一同位素峰峰寬的理論值除以離子所帶電荷數(shù)的值，結(jié)合質(zhì)譜儀峰寬，確定總峰寬。由相同m/z值的低分子量化合物的第一個(gè)同位素峰來確定，并將其作為多帶電蛋白質(zhì)的峰。

我們需要多大的質(zhì)量準(zhǔn)確性？能否實(shí)現(xiàn)，折中方案是什么？

考慮美國質(zhì)譜學(xué)會(huì)雜志作者指南中明確表征的要求（2004年3月）。對只含有C、H、O、N的化合物（C0-100，H3-74，O0-4和N0-4），在整數(shù)質(zhì)荷比為118，響應(yīng)誤差不超過34ppm時(shí)即可明確確定其化學(xué)組成，而在整數(shù)質(zhì)荷比為750時(shí)，響應(yīng)準(zhǔn)確性需好于0.018ppm，以消除"所有外部的可能性"。

圖15：對于化合物的明確鑒定，增加質(zhì)量準(zhǔn)確性的效益。（Quenzer，T.L., Robinson，J.M., Bolanios，B., Milgram. E. 和Greig, M.J.（作者），使用FTICR質(zhì)譜進(jìn)行自動(dòng)準(zhǔn)確的質(zhì)量分
析，關(guān)于質(zhì)譜和相關(guān)主題的50周年會(huì)議論文，Orlando, FL, 2002）.

圖16：對指定結(jié)果，在數(shù)據(jù)分析中增加過濾提條件或限制誤差，降低可能的候選物數(shù)量。

儀器間精確度的比較：毫質(zhì)量單位[mmu]，測量誤差[ppm]和分辨率

按照VIMMS計(jì)劃的準(zhǔn)確質(zhì)量最佳實(shí)踐指南（為起始計(jì)劃，構(gòu)成了部分英國測量體系），準(zhǔn)確質(zhì)量測定的絕大多數(shù)儀器要求能夠?qū)崿F(xiàn)10ppm或更佳的精確度。準(zhǔn)確度在2mmu之內(nèi)的現(xiàn)代質(zhì)譜儀，對計(jì)算質(zhì)量為118Da的物質(zhì)進(jìn)行測量，結(jié)果出現(xiàn)17ppm的誤差，按照今天的標(biāo)準(zhǔn)，明確確定化學(xué)物質(zhì)的分子式，這一誤差已經(jīng)能滿足要求：
計(jì)算得到的單同位素準(zhǔn)確質(zhì)量 = 118 Da
測量的準(zhǔn)確質(zhì)量 = 118.002 Da
偏差 = 0.002 mmu
誤差[偏差/準(zhǔn)確質(zhì)量x106] = 17 ppm

一臺(tái)質(zhì)譜儀對750m/z產(chǎn)生響應(yīng)，準(zhǔn)確度也為2mmu，誤差將達(dá)到2.7ppm。在第一種情況下，按照美國質(zhì)譜學(xué)會(huì)雜志的發(fā)行標(biāo)準(zhǔn)，對化合物分子式的明確鑒別，測量已經(jīng)足夠。但是對后一種情況，測量不夠精確。只有最高效的傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FTICR），對較高的質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)這樣的精確度。一種評(píng)定儀器質(zhì)量準(zhǔn)確測量能力（類似于預(yù)期使用）的綜合方法，通過均方根或均方根誤差測量（RMS）誤差計(jì)算。從商業(yè)化的TOF質(zhì)譜儀的質(zhì)量測量準(zhǔn)確要求中選取了下列內(nèi)容，說明它怎樣使用。

"在通常工作條件下，儀器的質(zhì)量測量準(zhǔn)確性，在指定的m/z范圍內(nèi)，將好于指定ppm RMS，這是基于被測物峰（屬于指定m/z）大量連續(xù)重復(fù)測量并選擇適合的參照峰（屬于指定的m/z）得出的結(jié)論。被測物和參照峰必須有足夠的強(qiáng)度，不受其它物質(zhì)的干擾。

有一些關(guān)鍵點(diǎn)和假設(shè)需要考慮：
1. 按照校正標(biāo)準(zhǔn)，已經(jīng)用已知質(zhì)量的峰對儀器進(jìn)行了校正。參照峰被用于解釋儀器隨時(shí)間校正中出現(xiàn)的任何改變，并使用被測物峰確定質(zhì)量測定的準(zhǔn)確性。
2. 正常的工作條件也包括在色譜條件的細(xì)節(jié)（LC/MS性能的說明）與任何相關(guān)的MS工作條件（例如，質(zhì)量分辨率、目標(biāo)m/z或質(zhì)譜采集速率）。
3. 強(qiáng)度足夠假定離子數(shù)，對考查中的質(zhì)譜儀（質(zhì)量測定）準(zhǔn)確性和精確性的表征不造成有害的影響。離子過少不利于離子的統(tǒng)計(jì)，離子過多會(huì)引起檢測器飽和，這兩者一起作用，將引起重復(fù)測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差出現(xiàn)更大的改變，將反向影響RMS誤差的計(jì)算（也與儀器校正相關(guān)）。
4. 無干擾-假定已知質(zhì)量峰的質(zhì)量測定不受相同或相似離子的干擾。重疊峰造成質(zhì)量測定的準(zhǔn)確性較差，這也不利于質(zhì)譜儀準(zhǔn)確性或精確性的正確表征（也與質(zhì)譜儀的校正相關(guān)）。
5. 參照是m/z范圍的好的表示法，這與特定樣品類型的分析相關(guān)。使用下列關(guān)系式，計(jì)算RMS誤差，在此Eppm是ppm誤差，n是考察質(zhì)量的數(shù)量:

RMS誤差不允許一些測定落在ppm誤差的"目標(biāo)窗"之外（例如，5ppmRMS）。為了確保測定的質(zhì)量，對大量重復(fù)進(jìn)樣，以上描述的條件需要得到滿足（尤其關(guān)于強(qiáng)度和干擾物的影響-在圖譜中具有清楚的峰輪廓的平衡離子統(tǒng)計(jì)）。您所見的報(bào)告的很多分辨率和質(zhì)量準(zhǔn)確性的數(shù)值不是RMS誤差值，而是來自單個(gè)選定（適合的）的離子。記住這一點(diǎn)很重要，在所有的應(yīng)用中，弱信號(hào)產(chǎn)生不好的離子統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，因此是不能用的。過強(qiáng)的信號(hào)同樣不適合使用，造成檢測器飽和。理想的平衡離子統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，在圖譜中具有清晰度，這是分析的目標(biāo)。一些比較：

關(guān)于圖17：
- 四極桿分辨率不能完全區(qū)分兩種化合物。
- 分辨力大約為5000，TOF數(shù)據(jù)清楚地顯示兩明確的峰，能夠準(zhǔn)確的進(jìn)行質(zhì)量測量，誤差小于5ppm。

在準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)的精確度中，通過質(zhì)量定義的改變、提高的分辨率和諸如峰形和校正需求等因素理解各種內(nèi)部的相互作用，這一點(diǎn)很重要。如果不能清楚地理解這些，沒有考慮到質(zhì)量的誤分配，那么將會(huì)出現(xiàn)其它意想不到的結(jié)果。

圖17：重疊圖譜表明四極f桿和TOF產(chǎn)生的響應(yīng)，在TOF數(shù)據(jù)中兩種質(zhì)量值處于1mDa的準(zhǔn)確質(zhì)量范圍之內(nèi)。在圖中，不同組分的兩種碎片來自相同的被測物，并且同時(shí)處于離子源。對這種情況，采用最佳的色譜法也不起作用，因此需強(qiáng)調(diào)一點(diǎn)，較高的分辨率是有用的，尤其對未知分子的分析。這同樣完全適合于QTOF產(chǎn)物離子數(shù)據(jù)與三重四極桿產(chǎn)物離子數(shù)據(jù)之間的比較。較高分辨率的另外的一個(gè)好處是，允許含氧和含烷基被測物的提取離子電流（XIC）圖從總色譜圖選擇性地被提取而區(qū)分，四極桿數(shù)據(jù)由于分辨率低，做不到這一點(diǎn).

圖 18：當(dāng)質(zhì)量增加時(shí)，相對于峰高來說，要正確確定單同位素質(zhì)量和平均質(zhì)量，分辨率變得越來越重要。*