原理

Confocal利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測(cè)器前的探測(cè)針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測(cè)，來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測(cè)針孔上，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測(cè)針孔阻擋。照明針孔與探測(cè)針孔對(duì)被照射點(diǎn)或被探測(cè)點(diǎn)來說是共轆的，因此被探測(cè)點(diǎn)即共焦點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面即共焦平面。計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測(cè)點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺(tái)沿著Z軸上下移動(dòng)，將樣品新的一個(gè)層面移動(dòng)到焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動(dòng)，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。

共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別

1 、抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像

2、具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片

3、增加側(cè)向分辨率

4、由于點(diǎn)對(duì)點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響

激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn)：

1、點(diǎn)照明

2、具有照明pinhole和探測(cè)pinhole

3、照明pinhole和探測(cè)pinhole共軛（共焦）、共焦點(diǎn)即被探測(cè)點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面為共焦平面

4、具有掃描系統(tǒng)——逐點(diǎn)掃描成像

5、具有多個(gè)（四個(gè)）熒光通道，可同時(shí)探測(cè)多個(gè)被標(biāo)記物

技術(shù)指標(biāo)（Leica TCS SP2）:

1、 xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x

傳統(tǒng)顯微鏡:Rxy=0.61λ/NA （0.25μm）

Confocal: Rxy=0.41λ/NA （0.18 μm）

2 、樣品的最大厚度：

取決于：物鏡的NA、物鏡的工作距離

              激光的穿透力、樣品的透明度

              Z軸的最大移動(dòng)范圍（166μm、Z-wide）

3、樣品的最小光切厚度:（載物臺(tái)最小移動(dòng)距離為40nm）

取決于：物鏡的NA、針孔大小

              Z軸的最小移動(dòng)步距:40nm

              Z軸的分辨率:0.35μm

4、激光器

Ar激光器：458nm, 476nm, 488nm, 514nm

GreNe ：543nm；HeNe ：633nm

Ar激光器(UV): 361nm

激光器的特點(diǎn)：

1）方向性好：激光基本延直線傳播

2）單色性好：AX=10-8nm

3）高亮度：激光方向性好，其在空間上的能量分布是高度集中的。

4）偏振性：激光為平面偏振光，光纖耦合

5.四個(gè)熒光通道，一個(gè)透射光通道

即除了可同時(shí)釆集多標(biāo)記熒光圖像外還可以同時(shí)釆集透射光圖像，但透射光圖像為非共焦圖像。

6.掃描速度：

slow           2201ines/s     512x512         2-3秒

slow2         4401ines/s  （2：雙向掃描）

medium      4501mes/s     512x512          1.7秒

medium2    9001ines/s

fast           1000lines/s    512x512          0.7秒

                                     128x128          0.2 秒

fast2          20001ines/s

7.掃描密度：

64x64

128x128

512x512

1024x1024

2048x2048

功能：

1、多熒光標(biāo)記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集

2、無損傷、連續(xù)光學(xué)切片,顯微?

3、真正的三維重組

4、假三維圖的顯示

5、可沿Z軸（xy平面）和Y軸（xz平面）方向進(jìn)行光切

6、定量分析

7、時(shí)間序列掃描:xyt、xyzt和xt掃描

8、圖像處理

9、旋轉(zhuǎn)掃描

10、感興趣區(qū)域掃描

11、光譜掃描

應(yīng)用：

1、定位、定量

2、三維重組

3、動(dòng)態(tài)測(cè)量

·活細(xì)胞或組織內(nèi)游離分布和濃度的變化，測(cè)量（、、、）

· 自由基的檢測(cè)

· 藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程、定位分布及定量

· 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位

一、定位、定量

1、免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三標(biāo)）的定位、定量：如：細(xì)胞膜受體或抗原的分布，微絲、微管的分布、兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細(xì)胞器的共定位、核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位和干細(xì)胞的增值、分化

2、細(xì)胞凋亡：AnnexinV-fitc + PI末端原位雜交-fitc + PI

3、熒光原位雜交：染色體基因定位

定位、定量研究中常用熒光探針

1、Amine-Reactive Probes

與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標(biāo)記等

1）細(xì)胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋白

免役熒光標(biāo)記：與抗體耦聯(lián)，

直標(biāo):一抗+熒光探針

間標(biāo):二抗+熒光探針

如:微管蛋白tublin （抗tublin抗體+熒光探針）

肌動(dòng)蛋白actin （Palloidine+熒光探針）

2）細(xì)胞膜表面受體

配體+熒光探針

如:nAchR、mAchR、多巴胺受體（DI,D2）

標(biāo)記Gml:霍亂毒素受體

霍亂毒素+FITC

2 .標(biāo)記細(xì)胞器熒光探針

1）線粒體 Mitochondria

Rodamin 123 505/534 , 可染活細(xì)胞，陽離子，可檢測(cè)線粒體膜電位，且在多數(shù)細(xì)胞中停留時(shí)間短。

JC1,線粒體膜電位低時(shí)為單體490/527發(fā)綠光線粒體膜電位高時(shí)為多聚490/590發(fā)紅光可標(biāo)記活細(xì)胞線粒體，且為檢測(cè)線粒體膜電位最佳探針。

Mitotracker Green FM 490/516,染活細(xì)胞或固定細(xì)胞，穩(wěn)定不漏出。

Mitotracker Orange CMTMRos 551/576,（氧化型）

Mitotracker Orange還原型，只能染活細(xì)胞。

2）溶酶體 Lysosome

中性紅541/640：微偏堿性，可標(biāo)記溶酶體等酸性器官

為非特異性

AO：

LysoTracker Green DND-26 504/511,染活細(xì)胞

LysoTracker Blue

LysoTracker Red

3）內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Endoplasmic Reticulum

DiOC6 484/500：非特異性，較高濃度標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，較低濃度標(biāo)記線粒體

4）高爾基體 Golgi apparatus

NBD C6-ceramie 466/536,可染活或死細(xì)胞

細(xì)胞器的單克隆抗體

5）細(xì)胞核

3、GFP綠色熒光蛋白

GFP的的發(fā)現(xiàn)：60年代，Shimomura等首先從水母中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren),該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實(shí)在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白GFP,后經(jīng)研究表明，在水母體內(nèi)和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后,水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光，GFP在藍(lán)光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光。

將外源基因與GFPDNA相連，GFP可作為外源基因的報(bào)告基因?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)外源基因的表達(dá)。

GFP主要應(yīng)用：

●對(duì)活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動(dòng)態(tài)觀察。

        可實(shí)時(shí)原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時(shí)空表達(dá)，如某種轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位、蛋白激酶C的膜轉(zhuǎn)位等。

●GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可動(dòng)態(tài)觀察該分泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過程。

●GFP基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連，就能顯示活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及病理過程。

●可用于觀察分子的運(yùn)動(dòng)(FRAP)

●蛋白之間的相互作用(FRET)

三.動(dòng)態(tài)測(cè)量

●Physiology:細(xì)胞內(nèi)離子動(dòng)態(tài)變化測(cè)量

1)、游離測(cè)量檢測(cè)游離變化熒光探針的原理:這類探針多為螯合劑，不與結(jié)合時(shí)不發(fā)熒光，通常也不能進(jìn)入細(xì)胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。:值為解離常數(shù)，表明檢測(cè)濃度的范圍:0.1x-10x,和很多因素有關(guān)，如pH、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細(xì)胞內(nèi)生理濃度值(10-100nm)，細(xì)胞內(nèi)超載濃度值(基礎(chǔ)濃度的10倍左右)

●程序化測(cè)量:用timelapse中 的編程按鈕可進(jìn)行不同時(shí)間序列的掃描測(cè)量。

●濃度絕對(duì)測(cè)量

1)單波長公式法

Fluo3: 530nm

=450nm

●測(cè)量時(shí)切記細(xì)胞內(nèi)靜息濃度的相對(duì)熒光強(qiáng)度值不能太低(F值不低于40)

細(xì)胞內(nèi)生理濃度值(-M)

細(xì)胞內(nèi)超載濃度值(基礎(chǔ)濃度的10倍左右)

2)標(biāo)準(zhǔn)曲線法

根據(jù)儀器條件和負(fù)載條件，以不同濃度的Buffer (EGTA-)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫軸為濃度，縱軸為熒光強(qiáng)度

3)比例熒光的測(cè)量

雙波長(比例熒光: ratio)

Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440)

快速變化的測(cè)量

1.改變掃描速度

2.釆用雙向掃描

3.減少釆樣點(diǎn)數(shù)(犧牲空間分辨率)

4.釆用線掃描(xt)

細(xì)胞器的測(cè)量

1.線粒體內(nèi)游離測(cè)量

Fluo-3 + TMRM（線粒體熒光探針，紅色）

2.特異定位的重組水母發(fā)光蛋白

水母發(fā)光蛋白與CT+結(jié)合后發(fā)藍(lán)光； 

用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細(xì)胞器蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可測(cè)定亞細(xì)胞器內(nèi)的游離變化；

目前已商品化的探針可檢測(cè)：線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核內(nèi)的游離,因生物發(fā)光很弱不能使用Confocal檢測(cè)。

細(xì)胞內(nèi)游離測(cè)量的應(yīng)用

·鈣的特性

1.細(xì)胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度-

2.細(xì)胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣明顯升高

3.細(xì)胞內(nèi)鈣為細(xì)胞激活"開關(guān)"

·細(xì)胞內(nèi)鈣的生理作用

1.肌肉的興奮收縮-收縮偶聯(lián)

2.神經(jīng)遞質(zhì)的釋放

3.學(xué)習(xí)記憶的增強(qiáng)

4.卵子受精

5.細(xì)胞分裂和再生

6.細(xì)胞調(diào)亡

7.細(xì)胞間通訊

8.細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)

9.DNA合成

10.基因表達(dá)

·細(xì)胞內(nèi)鈣超載與疾病

1.高血壓、腦缺血、心臟病、內(nèi)分泌病一胞內(nèi)鈣濃度異常。

2.糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化病一胞內(nèi)鈣濃度增高。

3.人體缺鈣一骨鈣大量丟失，神經(jīng)細(xì)胞的鈣濃度增高。

4.老化和老年性癡呆-神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增高。

細(xì)胞內(nèi)生理濃度值(-M)

細(xì)胞內(nèi)超載濃度值(基礎(chǔ)濃度的10倍左右)

電刺激引起骨骼肌細(xì)胞的振蕩

· pH值的檢測(cè):

BCECF-AM   490nm    530nm          6.5-7.5

Snarf-l-AM    488nm    580/640nm   7.0-8.0

●自由基的檢測(cè)

熒光探針:(504nm/529nm)

                2-氫，2氯熒光素乙酰乙酸鹽

胞外→擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi)→酯酶脫乙酰

DCF-H (不熒發(fā)光)→DCF (發(fā)熒光)

*樣品不能在鏡下用汞燈照射及觀察

Dihydrorhodamine 123 ( 507nm/529nm )

→被動(dòng)擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi)→在細(xì)胞內(nèi)被氧化成

rod123 (發(fā)光)

膜電位的測(cè)量：

標(biāo)記膜電位探針（慢反應(yīng)）:

JC1510nm530/590mn

Dioc5 ⑶548nm573nm

Dioc6(3)484mn500nm

快反應(yīng)探針：

D1-4-ANEPPS496mn703nm

D1-4-ANEPPS498nm713nm

細(xì)胞膜靜息膜電位：-70mV

線粒體膜電位：-150mV

以上均屬于陽高子探針，更容易與線粒體親和，為線粒體膜電位探針

熒光能量共振轉(zhuǎn)移

能量轉(zhuǎn)移：能量從分子的一個(gè)部位向另一個(gè)部位的傳遞,或能量從一個(gè)分子向另一個(gè)分子傳遞。能量的提供者叫能量供體，能量的接受者叫能量受體。

熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件：

·兩個(gè)熒光分子：供體-FL1,受體-FL2

·供體與受體的距離在2-7nm

·供體的發(fā)射波長與受體的激發(fā)波長一致

樣品要求：

1.經(jīng)熒光探劑標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)、三標(biāo)）

2.固定的或活的組織

3.固定的或活的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)培養(yǎng)在Confocal專用小培養(yǎng)皿或蠱玻片上

4.懸浮細(xì)胞，甩片或滴片后，用蓋玻片封片

例：長時(shí)間觀察活體阿爾茨海默病模型

小鼠β-淀粉蛋白形成的狀況