土茯苓Smilax glabra Roxb. 是治療痛風(fēng)的傳統(tǒng)中藥，《本草綱目》記載：“惟土茯苓氣平味苦而淡，為陽(yáng)明本藥，能健脾胃去風(fēng)濕。脾胃健則營(yíng)衛(wèi)從，風(fēng)濕去則筋骨利，故諸證多愈”?，F(xiàn)代研究表明，土茯苓含有黃酮、鞣質(zhì)、生物堿等有效成分，可促進(jìn)血尿酸排出體外，也可緩解尿酸鈉晶體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)^[1]。然而，土茯苓成分復(fù)雜多樣，僅研究其單體物質(zhì)治療痛風(fēng)的作用只能闡釋其部分藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，很難闡釋其真正的科學(xué)內(nèi)涵。

痛風(fēng)作為一種尿酸鈉晶體沉積于機(jī)體而引起的關(guān)節(jié)炎，與嘌呤代謝紊亂及尿酸排泄減少而形成的高尿酸血癥直接相關(guān)?，F(xiàn)已證實(shí)，促進(jìn)尿酸排泄是控制血清尿酸水平和痛風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵途徑，并進(jìn)一。此外，有研究證實(shí)痛風(fēng)相關(guān)的尿酸鈉晶體是通過(guò)產(chǎn)生軟骨降解酶和促炎細(xì)胞因子導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞^[4]，這表明痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)及多個(gè)機(jī)體調(diào)控位點(diǎn)都有一定的相關(guān)性，并非是單路徑調(diào)節(jié)作用。因此，通過(guò)多路徑對(duì)痛風(fēng)進(jìn)行研究顯得尤為重要。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于多向系統(tǒng)藥理學(xué)和生物學(xué)提出的藥物研究新方法，從多個(gè)角度將藥物成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與生物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，更加系統(tǒng)全面地研究藥物的作用機(jī)制^[5-6]。因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)土茯苓治療痛風(fēng)的成分及靶點(diǎn)進(jìn)行歸納整理，并通過(guò)系統(tǒng)生物學(xué)分析，深入揭示土茯苓成分-靶點(diǎn)-通路之間的協(xié)同作用，為探索土茯苓治療痛風(fēng)的機(jī)制提供新的思路。

1  方法

1.1  土茯苓成分收集與篩選

以“土茯苓”為關(guān)鍵詞在傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)TCMSP（http://lsp./tcmsp.php）中查找土茯苓所含成分，通過(guò)評(píng)價(jià)成分的體內(nèi)過(guò)程，用口服生物利用度（oralbioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-like，DL）≥0.18篩選中藥的活性成分^[6]。其中OB值是評(píng)價(jià)藥物能否發(fā)揮藥效的重要指標(biāo)，DL值代表成分與已知化學(xué)藥的相似性，對(duì)確定中藥成分是否對(duì)機(jī)體產(chǎn)生活性具有重要參考價(jià)值^[7]。

1.2  相關(guān)靶點(diǎn)信息的收集

將收集到的土茯苓有效成分導(dǎo)入到Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www./）中進(jìn)行蛋白靶點(diǎn)的匹配，得到成分結(jié)構(gòu)所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，并通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www./）查詢其蛋白所對(duì)應(yīng)的基因，進(jìn)行歸納整理^[7]。在TTD數(shù)據(jù)庫(kù)（https://db./ttd/）和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（http:// www.omim.org/）檢索與痛風(fēng)相關(guān)的靶點(diǎn)基因^[7]。

1.3  網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建和分析

將所得到的土茯苓有效成分和Drugbank中得到的靶點(diǎn)進(jìn)行歸納整理，所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape 3.6.0軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到土茯苓有效成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。在TTD數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索與痛風(fēng)相關(guān)的基因?qū)氲?/span>Cytoscape 3.6.0軟件并運(yùn)用Bisogenet插件構(gòu)建疾病蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，運(yùn)用Cytoscape 3.6.0中的Merge功能將2個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行合并得到土茯苓可能對(duì)痛風(fēng)起作用的靶點(diǎn)。將所得到的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入MAS 3.0系統(tǒng)（http://mas. capitalbiotech.com/mas3/）進(jìn)行基因本體（GO）分類富集分析和KEGG通路分析。GO分類富集分析包括分子功能分析、生物學(xué)過(guò)程分析、細(xì)胞組分分析^[8]。最后，將分析得到的靶點(diǎn)通路與土茯苓成分相對(duì)應(yīng)，形成有效成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

2  結(jié)果

2.1  土茯苓活性成分的篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索土茯苓化學(xué)成分，共得到74個(gè)化學(xué)成分，以OB≥30%和DL≥0.18為篩選條件，同時(shí)篩去無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的成分，最終共獲得14個(gè)潛在的有效成分（表1）。

2.2  靶點(diǎn)信息的收集和篩選

2.2.1  成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息的收集和篩選  將收集得到的土茯苓14個(gè)潛在有效成分導(dǎo)入到Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中配對(duì)得到了274個(gè)蛋白，將所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)查詢其對(duì)應(yīng)的基因。將結(jié)果導(dǎo)入到Cytoscape 3.6.0軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到土茯苓主要活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（圖1）。圖1共有227個(gè)節(jié)點(diǎn)、265條邊，紅色箭頭節(jié)點(diǎn)表示土茯苓活性成分，橢圓形節(jié)點(diǎn)表示作用靶點(diǎn)（黃色表示只有1個(gè)成分對(duì)應(yīng)此靶點(diǎn)，綠色表示有2個(gè)成分作用于此靶點(diǎn)，藍(lán)色表示有3個(gè)成分可作用于此靶點(diǎn)，粉紅色表示有4個(gè)成分可作用于靶點(diǎn)，紫色表示有5個(gè)成分可作用于此靶點(diǎn)），越往中心其靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)成分越多。從圖1中可看出經(jīng)篩選后14個(gè)土茯苓活性成分均具有多靶點(diǎn)，即相同的靶點(diǎn)可對(duì)應(yīng)于不同的活性成分，不同的靶點(diǎn)可以對(duì)應(yīng)相同的活性成分，體現(xiàn)出土茯苓具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。

2.2.2  疾病靶點(diǎn)信息的收集和篩選  在TTD數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與痛風(fēng)相關(guān)的基因，其中在TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到16個(gè)靶點(diǎn)，在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到36個(gè)靶點(diǎn)，合并篩去重復(fù)靶點(diǎn)后共得到50個(gè)靶點(diǎn)，將這些靶點(diǎn)導(dǎo)入到Cytoscape 3.6.0軟件，運(yùn)用Bisogenet插件構(gòu)建疾病蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。將此網(wǎng)絡(luò)與土茯苓主要活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)運(yùn)用Cytoscape3.6.0中的Merge功能相映射，取交集部分最終獲得39個(gè)土茯苓治療痛風(fēng)的靶點(diǎn)。將得到的39個(gè)靶點(diǎn)制成靶點(diǎn)間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖2。從圖2中可看出這39個(gè)靶點(diǎn)間有相互作用，表明可能在某種層面上這些靶點(diǎn)是相互聯(lián)系的并通過(guò)多途徑、多方面的協(xié)調(diào)起到抗痛風(fēng)的作用。

2.3  生物功能通路分析

為更進(jìn)一步探究其作用通路，將所得的39個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入到MAS 3.0系統(tǒng)中進(jìn)行GO分類富集分析（圖3）和KEGG生物路徑分析（圖4），列出分析結(jié)果排名前15的路徑。其中GO分類富集分析包括分子功能分析、細(xì)胞組分分析、生物學(xué)過(guò)程分析，從圖3中可以看出在分子功能層面上，土茯苓對(duì)蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、ATP結(jié)合等影響較大；在細(xì)胞組分中，土茯苓對(duì)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等影響較大；在生物學(xué)過(guò)程中，土茯苓對(duì)藥物反應(yīng)、泡沫細(xì)胞分化的抑制、血壓的調(diào)節(jié)、生物體之間的種間相互作用、脂質(zhì)代謝的負(fù)反饋調(diào)節(jié)等影響較大。圖4結(jié)果顯示，土茯苓治療痛風(fēng)主要涉及的排名前15的通路為脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、表皮生長(zhǎng)因子受體（ERbB）信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、B和T細(xì)胞受體信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路等。

2.4  土茯苓活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)模型

將富集分析得到的排名前15的通路對(duì)應(yīng)土茯苓治療痛風(fēng)的靶點(diǎn)及成分，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)模型。此網(wǎng)絡(luò)由61個(gè)節(jié)點(diǎn)和121條邊構(gòu)成，綠色節(jié)點(diǎn)代表土茯苓中的活性成分，粉紅色節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn)，黃色箭頭節(jié)點(diǎn)代表調(diào)控通路，邊代表三者之間的相互作用，圖中節(jié)點(diǎn)越大表明其對(duì)痛風(fēng)的影響越大（圖5）。分析結(jié)果表明，MAPK1、核轉(zhuǎn)錄因子65（RELA）、前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2（PTGS2）這3個(gè)靶點(diǎn)基因的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度排位靠前，為網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，表明它們可能是土茯苓治療痛風(fēng)的核心作用靶點(diǎn)。每種活性成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，每個(gè)靶點(diǎn)連接多種成分，體現(xiàn)了土茯苓多成分、多靶點(diǎn)治療痛風(fēng)的作用機(jī)制。同時(shí)多條通路之間是通過(guò)共有靶點(diǎn)連接而非獨(dú)立分開的，表明各條通路之間可發(fā)揮協(xié)同作用起到治療痛風(fēng)的作用。

3  討論

0%和DL≥0.18的土茯苓候選成分，經(jīng)痛風(fēng)疾病靶點(diǎn)對(duì)接得到11個(gè)活性化學(xué)成分。其中，8個(gè)化合物有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，分別為β-谷甾醇^[9]、谷甾醇^[10]、柚皮素^[11]、豆甾烯醇^[12]、落新婦苷^[13]、花旗松素^[14]、薯蕷皂苷元^[15]、槲皮素^[16]。除此之外，存在一些尚未被報(bào)道的生物過(guò)程及有效成分，這些生物過(guò)程和有效成分的功效將成為未來(lái)研究土茯苓抗痛風(fēng)的潛在方向，如4,7-二羥基-5-甲氧基-6-甲基-8-甲?；S烷、順式-二氫槲皮素、(?)-花旗松素等，其藥效學(xué)及作用機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)及多個(gè)機(jī)體調(diào)控位點(diǎn)都有一定的相關(guān)性。因此，本研究共預(yù)測(cè)得到MAPK1、RELA、PTGS2等39個(gè)土茯苓治療痛風(fēng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中，MAPK1作為炎癥常用通路中的一員，其與炎癥的嚴(yán)重程度有密切關(guān)系，為重要的炎癥評(píng)價(jià)指標(biāo)^[17]。RELA基因可編碼產(chǎn)生核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）p65亞基蛋白并參與NF-κB二聚體的形成，而NF-κB幾乎是所有細(xì)胞類型中都存在的多效轉(zhuǎn)錄因子，是一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的終點(diǎn)，許多生物過(guò)程如炎癥、免疫、分化、細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡等都與其具有非常密切的關(guān)系，所以常以此靶點(diǎn)作為評(píng)價(jià)藥物抗痛風(fēng)作用的指標(biāo)^[18]。而PTGS2則負(fù)責(zé)炎癥性前列腺素的產(chǎn)生，參與炎癥和有絲分裂的發(fā)生，同時(shí)PTGS2與其他預(yù)測(cè)所得出的靶點(diǎn)都有密切聯(lián)系。因此，這些靶點(diǎn)都在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、細(xì)胞凋亡等生物過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，同樣也是治療痛風(fēng)的重要靶點(diǎn)。

本研究將所得到的靶點(diǎn)通過(guò)GO富集化分析得到與痛風(fēng)密切相關(guān)的通路，如ErbB信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、B和T細(xì)胞受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。這些通路與炎癥以及代謝性障礙密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明土茯苓治療痛風(fēng)具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，下一步也將對(duì)所預(yù)測(cè)出來(lái)的靶點(diǎn)通路進(jìn)行科學(xué)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究土茯苓治療痛風(fēng)的機(jī)制，闡述了多靶點(diǎn)與多成分間復(fù)雜網(wǎng)狀相互作用關(guān)系，為進(jìn)一步系統(tǒng)地開展土茯苓治療痛風(fēng)的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)（略） 

來(lái)  源：郭  璐，夏道宗，駱葉姣，張曉熙，趙鑫鈺. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討土茯苓治療痛風(fēng)的作用機(jī)制 [J]. 中草藥, 2019, 50(6):1413-1418.