Edman降解是蛋白質(zhì)測(cè)序中一個(gè)非常重要的反應(yīng)步驟，因?yàn)橥ㄟ^(guò)該反應(yīng)可以對(duì)蛋白質(zhì)有序的氨基酸組成進(jìn)行分析。自動(dòng)化Edman測(cè)序儀現(xiàn)在已得到廣泛使用，他們能夠?qū)﹂L(zhǎng)約50個(gè)氨基酸的肽進(jìn)行測(cè)序。以下概括了使用Edman降解進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)序的步驟，隨后還將對(duì)其中一些重要步驟做詳細(xì)說(shuō)明。

1. 用2-巰基乙醇等還原劑破壞蛋白質(zhì)中的任意二硫鍵，過(guò)程中可能需要一個(gè)保護(hù)基團(tuán)（例如碘乙酸）以防止化學(xué)鍵重新形成；

2. 果蛋白質(zhì)不止一個(gè)，則需要分離并純化蛋白質(zhì)混合物中的各條肽鏈；

3. 確定每條鏈中的氨基酸組成；

4. 確定每條鏈末端的氨基酸；

5. 將每條鏈斷裂成50個(gè)氨基酸以下的片段；

6. 分離并純化肽片段；

7. 確定每個(gè)肽片段的序列；

8. 使用其他裂解方式重復(fù)以上步驟；

9. 構(gòu)建整條蛋白質(zhì)序列。

Edman測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程圖（來(lái)源：百泰派克）

蛋白質(zhì)裂解成肽片段的過(guò)程

長(zhǎng)度超過(guò)50-70個(gè)氨基酸的肽不能通過(guò)Edman降解來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)序。因此，需要將長(zhǎng)蛋白鏈裂解成小片段，然后再進(jìn)行單獨(dú)測(cè)序。裂解過(guò)程可以通過(guò)內(nèi)肽酶（例如胰蛋白酶或胃蛋白酶）進(jìn)行，也可以通過(guò)化學(xué)試劑（例如溴化氰）進(jìn)行。不同的酶具有不同的切割模式，片段之間的重疊可用于構(gòu)建整體蛋白質(zhì)序列。

Edman反應(yīng)過(guò)程

將待測(cè)序的蛋白質(zhì)吸附到固體表面上。常見(jiàn)的一種基材是涂有聚丁二烯(一種陽(yáng)離子聚合物)的玻璃纖維。將Edman試劑苯基異硫氰酸酯（PITC）與12％三甲胺的弱堿性緩沖溶液一起添加到吸附的蛋白質(zhì)中，將所得物與氨基酸N端的胺基進(jìn)行反應(yīng)。

然后通過(guò)添加無(wú)水酸來(lái)選擇性地分離末端氨基酸。接著，該衍生物異構(gòu)化，得到替代物苯基硫代乙內(nèi)酰脲。洗掉該替代物并通過(guò)色譜法鑒定，重復(fù)整個(gè)循環(huán)。每個(gè)步驟的效率約為98％，能有效地鑒定約50個(gè)氨基酸。

蛋白質(zhì)測(cè)序儀的使用

蛋白質(zhì)測(cè)序儀是一種以自動(dòng)化方式執(zhí)行Edman降解的機(jī)器。將蛋白質(zhì)或肽的樣品固定在蛋白質(zhì)測(cè)序儀的反應(yīng)容器中，進(jìn)行Edman降解。每個(gè)循環(huán)從蛋白質(zhì)或肽的N端釋放并衍生一個(gè)氨基酸，然后通過(guò)HPLC鑒定生成的氨基酸衍生物。對(duì)整個(gè)多肽重復(fù)進(jìn)行測(cè)序過(guò)程，直到測(cè)定了完整的可測(cè)量序列或提前設(shè)定的循環(huán)次數(shù)為止。