在上一篇理茶德給大伙帶來的非腫瘤生信分析開車指導(dǎo) (非腫瘤生信分析：來不及解釋了快上車！) 后，這次由蝦餃皇來給大家?guī)硪黄?span style="max-width: 100%;letter-spacing: 0.544px;orphans: 4;text-align: start;white-space: pre-wrap;caret-color: rgb(51, 51, 51);color: rgb(171, 25, 66);overflow-wrap: break-word !important;">非腫瘤生信數(shù)據(jù)挖掘文章分析啦！此外，我們近期會推出20期左右的非腫瘤生信數(shù)據(jù)分析給大家作為參考。  

        今天給大家?guī)淼氖?020年3月發(fā)表在J. Cell. Mol. Med.（4.658）雜志上的文章“STAT1 and its related molecules as potential biomarkers in Mycobacterium tuberculosis infection ”。這篇文章中作者通過分析肺結(jié)核隊列GSE83456的表達數(shù)據(jù)，篩選出192個表達差異基因，進而通過進行富集分析表明這些干擾素信號傳導(dǎo)途徑，并且與防御反應(yīng)有關(guān)。隨后，作者進行miRNA預(yù)測，繪制miRNA網(wǎng)絡(luò)，并使用qRT-PCR驗證了兩個靶基因為STAT1的miRNA，最后作者預(yù)測了這兩個miRNA的circRNA。

一.研究背景

結(jié)核?。═B）是一種慢性傳染病，其臨床表現(xiàn)為長期低燒，咳痰和咯血，其致病菌為結(jié)核分枝桿菌（MTB），其中最常見的感染類型為肺結(jié)核（PTB），同時MTB還可以感染腸管、淋巴腺、關(guān)節(jié)、脊柱、泌尿生殖系統(tǒng)和其他器官或組織，導(dǎo)致人替功能障礙和器官組織損傷。結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展和結(jié)局不僅與細菌的毒性和數(shù)量，還與人體的免疫功能密切相關(guān)。人體抗結(jié)核免疫主要是細胞免疫，其中細胞因子與各類免疫細胞亞型在免疫防御起關(guān)鍵作用。此外，MTB可以阻礙氧化應(yīng)激，細胞凋亡和自噬，并抑制組織相容性復(fù)合物分子的合成，從而影響抗原呈遞。

二.分析流程

三.結(jié)果解讀

1.樣品信息處理和表達差異基因的篩選

• 圖1：對GSE83456數(shù)據(jù)庫（排除免疫抑制性疾病的45例PTB樣品和61例健康樣品）的表達數(shù)據(jù)進行分析，篩選出192個表達差異基因，其中156個上調(diào)基因和36個下調(diào)基因。

2.表達差異基因主要富集于主要在干擾素（INF）信號通路和免疫應(yīng)答

• 圖2：GSEA分析顯示PTB樣本在干擾素-α/γ反應(yīng)和免疫相關(guān)的功能中顯著富集。

• 圖3A：對192個表達差異基因進行GO富集分析,表明PTB樣品中表達差異基因主要與干擾素信號通路和免疫應(yīng)答有關(guān)，其中顯著富集是I型干擾素信號通路

• 圖3B：ClueGO分析生物過程的相互作用網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape ClueGo插件可視化。

• 圖4：使用Funrich軟件進行富集分析，其中有163個基因用于進一步分析，表達差異基因主要富集于干擾素信號傳導(dǎo)通路和免疫相關(guān)通路。

• 圖5：使用IPA對192個表達差異基因進行核心分析，有干擾素信號通路、模式識別受體在細菌和病毒識別中作用、被胞質(zhì)模式識別受體激活的IRF、抑瘤素M信號、TREM1信號、死亡受體信號、神經(jīng)炎癥信號通路和和T細胞衰竭信號通路被激活。其中干擾素通路激活分數(shù)最高，其中STAT1、MX1、OAS1、SOCS1、STAT2、TAP1、IFI6、 IFI35、IFIT1、IFIT3、IFITM1、IFITM3、ISG15和JAK2與該通路相關(guān)。

• 圖6：IPA的生物學(xué)功能分析展示了差異基因與炎癥、抗病毒應(yīng)答、免疫應(yīng)答、活化、抗微生物應(yīng)答、吞噬作用、趨化性、細胞運動、先天免疫應(yīng)答和應(yīng)答功能模塊有關(guān)。其中具體的模塊為細胞吞噬作用的免疫應(yīng)答、巨噬細胞的免疫應(yīng)答、抗病毒應(yīng)答和先天免疫應(yīng)答，被抑制的模塊為大腦的免疫反應(yīng)和腦炎。同時，進行上游分析，其中排名前五的調(diào)節(jié)物為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子：STAT1、IRF7和細胞因子：IFNL1、IFNG、IFNA2

• 小結(jié)：作者使用GSEA分析、GO富集分析、Funrich富集分析、IPA核心分析與生物學(xué)功能分析證明了PTB樣品中的表達差異基因主要富集于干擾素（INF）信號通路和免疫應(yīng)答。

3.構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)進一步挖掘免疫相關(guān)基因

• 圖7：構(gòu)建192個表達差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，有170個基因和1121種相互作用關(guān)系，不同顏色代表使用被MCODE識別的不同基因簇，黃色得分最高。

• 表3：對得分最高的基因簇（圖7黃色）進行BP富集分析，發(fā)現(xiàn)該基因簇主要為防御反應(yīng)和免疫系統(tǒng)相關(guān)功能的基因。

• 圖8A：使用STRING對得分最高的基因簇進行分析，所有基因主要與對病毒的防御反應(yīng)、干擾素信號傳導(dǎo)、干擾素α/β信號、細胞因子信號以及免疫系統(tǒng)相關(guān)通路有關(guān)。其中紅色表示與干擾素信號相關(guān)；藍色表示與干擾素α/β信號相關(guān)；綠色表示與免疫系統(tǒng)中細胞因子信號相關(guān)；黃色表示與干擾素-γ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。

• 圖8B：使用Network Analyst驗證，并且得到的基因于STRING上的基因取交集得到23個基因用于進一步分析。

4.miRNA挖掘

• 圖9：作者篩選出28個與細胞因子信號相關(guān)基因進行了gene-miRNA分析，作者使用了TargetScan、miRanda、miRDB、miRWalk和RNA22數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA，并且得到的結(jié)果取交集作為預(yù)測結(jié)果，并且使用Cytoscape繪制miRNA的基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)，并且篩選出有兩個靶基因的9個miRNA進行進一步驗證。

5.qRT-PCR驗證潛在的生物標(biāo)志物表達

• 圖10：qRT-PCR驗證，展示了兩個靶基因為STAT1為的miRNA（miR-223-3p和miR-448）在結(jié)核病患者血漿中明顯低于健康人的血漿。

6.circRNA預(yù)測

使用StarBase預(yù)測hsa-miR-223-3p和hsa-miR-448的相應(yīng)circRNA，得到兩個circRNA：SAMD8_ hsa_circRNA994和TWF1_hsa-circRNA9897。

最后小結(jié)一下，作者對肺結(jié)核隊列的表達數(shù)據(jù)進行分析，并篩選出總共192個表達差異基因使用GO分析、GSEA分析、Funrich富集分析、IPA核心分析與生物學(xué)功能分析等方法確定這些基因大多數(shù)都富集于干擾素信號傳導(dǎo)途徑，并且與防御反應(yīng)有關(guān)。隨后，作者使用TargetScan、miRanda、miRDB、miRWalk和RNA22數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA，進而進行qRT-PCR驗證，篩選出靶基因為STAT1的miRNA（hsa-miR-448和hsa-miR-223-3p）它們在肺結(jié)核患者血漿中下調(diào)，最后作者使用StarBase預(yù)測了相應(yīng)circRNA。