by 菜泡飯

原文鏈接：

https://www.ncbi.nlm./pmc/articles/PMC5934679/

知識(shí)點(diǎn)積累

1. m6A作為mRNA的普遍的修飾，在含有METTL3的甲基轉(zhuǎn)移酶時(shí)mRNA前體轉(zhuǎn)錄后立即發(fā)生m6A甲基化;而FTO和ALKBH5負(fù)責(zé)m6A去甲基化。 通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶之間的相互作用，m6A水平保持平衡，形成m6A結(jié)合蛋白的對(duì)接位點(diǎn)和RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的適當(dāng)組裝。具有足夠的m6A水平的mRNA轉(zhuǎn)錄物可被適當(dāng)剪接，轉(zhuǎn)運(yùn)，翻譯或降解。隨著m6A測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和成熟，目前發(fā)現(xiàn)在非編碼RNA如lincRNA，miRNA，circRNA等中均存在m6A修飾，然而在非編碼RNA中m6A修飾的功能尚未被完全探索，給予研究者廣大的研究空間。

2. LincRNA：位于編碼蛋白的基因之間，其中長(zhǎng)度超過(guò)200nt的非編碼RNA。目前對(duì)其的功能研究主要為以下幾個(gè)方面1、轉(zhuǎn)錄干擾；2、誘導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)和核小體修飾；3、調(diào)控可變剪接模式；4、產(chǎn)生內(nèi)源siRNAs；5、調(diào)控蛋白質(zhì)的活性；6、結(jié)構(gòu)或組織功能；7、改變蛋白質(zhì)的定位；8、小RNA的前體等。

3. ce RNA：competing endogenous RNAs,內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA。已知microRNA可以通過(guò)結(jié)合mRNA導(dǎo)致基因沉默，而ceRNA可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合microRNA來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。ceRNA可以通過(guò)應(yīng)答元件（microRNAresponse elements，MREs)與microRNA結(jié)合從而影響microRNA導(dǎo)致的基因上調(diào)，這揭示了一條RNA->microRNA調(diào)節(jié)通路的存在，具有重大生物意義。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了研究lincRNA 1281在鼠源性胚胎干細(xì)胞中的功能，首先作者用RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)抑制小鼠胚胎干細(xì)胞分化可明顯下調(diào)lincRNA1281的表達(dá)。又用RNA FISH實(shí)驗(yàn)明確了lincRNA1281在細(xì)胞中的定位（胞質(zhì)），為后續(xù)研究lincRNA 1281的功能在提供位置上的引導(dǎo)。那么敲低lincRNA1281對(duì)胚胎干細(xì)胞到底有怎樣的影響呢？作者用shlincRNA1281的細(xì)胞做了一系列表型實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)敲除lincRNA 1281對(duì)胚胎干細(xì)胞的再生能力并沒(méi)有影響，主要體現(xiàn)在一些再生能力指標(biāo)沒(méi)有什么變化。而敲除lincRNA1281后，胚胎干細(xì)胞的分化能力顯著下降，主要表現(xiàn)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的畸胎瘤體積和重量減小，畸胎瘤的一些列分化指標(biāo)的下降。以上提示linc RNA1281對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞的分化潛能至關(guān)重要，且為促進(jìn)作用。

2.linc RNA 1281存在m6A修飾且與lincRNA 1281在鼠胚胎干細(xì)胞中的作用正相關(guān)

以往文獻(xiàn)提示在胚胎干細(xì)胞分化過(guò)程中，m6A發(fā)揮相當(dāng)重要的作用，且非編碼的lincRNA的m6A修飾也已有報(bào)道。作者想要了解在鼠源胚胎干細(xì)胞中，lincRNA是否存在m6A修飾以及發(fā)生m6A修飾的linc RNA 1281發(fā)揮著怎么樣的作用。首先作者通過(guò)MeRIP實(shí)驗(yàn)證明linc RNA1281存在m6A修飾，且敲低mettl3后lincRNA 1281本身表達(dá)并未受到影響而lincRNA 1281上的m6A修飾顯著下降。那么lincRNA 1281的m6A修飾位點(diǎn)具體在哪里呢？根據(jù)linc RNA1281的m6A修飾預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)，作者做了一些列的突變實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)A916,1024 and 1054-G這三個(gè)都是m6A的修飾位點(diǎn)。那么m6A修飾對(duì)lincRNA 1281在鼠胚胎干細(xì)胞中的作用又有什么樣的影響呢？于是作者做了一些列常規(guī)敲除和rescure實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)A-G突變的lincRNA 1281即不存在m6A修飾的linc RNA 1281無(wú)法rescure敲除linc RNA1281對(duì)鼠胚胎干細(xì)胞分化能力的影響。即linc RNA 1281的m6A修飾可促進(jìn)鼠胚胎干細(xì)胞的分化。

既然前文已經(jīng)提到linc RNA 1281在鼠胚胎干細(xì)胞中促進(jìn)其分化，那么它是如何起到促進(jìn)分化的作用的呢? 根據(jù)linc RNA 1281的在胞質(zhì)中的定位以及目前了解到的其常規(guī)功能，作者猜想其是否可作為一個(gè)ce RNA來(lái)發(fā)揮其作用。那么lincRNA1281又是作為誰(shuí)的ce RNA？目前我們比較常見的模式是lncRNA-miRNA-mRNA，因此作者猜想lincRNA 可能作為與胚胎干細(xì)胞分化能力有關(guān)的miRNA的ceRNA從而影響miRNA 與目的功能基因的結(jié)合。通過(guò)文獻(xiàn)搜索發(fā)現(xiàn)let-7/lin28是與胚胎干細(xì)胞分化能力這個(gè)表型密切相關(guān)的經(jīng)典miRNA-mRNA軸，于是作者猜想lincRNA 1281可否作為let-7家族的ceRNA。那么要驗(yàn)證這個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，我們常?guī)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)即luciference 雙熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)let-7家族的miRNA是否的確能與lincRNA 1281結(jié)合。于是構(gòu)建包含linc 1281全長(zhǎng)的報(bào)告系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)let-7家族的miRNA都能與linc RNA 1281結(jié)合，且結(jié)合位點(diǎn)分別為425-431以及965-971，這與let-7家族的具體成員有關(guān)。既然要證明兩者結(jié)合，除了用miRNA 去結(jié)合lincRNA 檢測(cè)熒光素活性外，反向即可用linc RNA 和結(jié)合蛋白復(fù)合體去拉miRNA 結(jié)果RIP實(shí)驗(yàn)證明的確兩者存在相互結(jié)合。而且敲除lincRNA1281后，由于與lincRNA結(jié)合的miRNA 減少，因此游離出來(lái)用RT-PCR可檢測(cè)的miRNA 增加，對(duì)目的基因lin28的抑制作用也增加。

那么m6A在lincRNA1281充當(dāng)ceRNA中發(fā)揮什么作用呢？作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲除mettl3或者突變lincRNA 1281的m6A修飾位點(diǎn)后，再做luciference實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)lincRNA 1281和let-7家族的結(jié)合能力下降。經(jīng)典套路，即敲除和recure。

為了進(jìn)一步研究這個(gè)ceRNA model是否介導(dǎo)lincRNA1281調(diào)節(jié)的鼠源性胚胎干細(xì)胞分化能力，作者敲除lincRNA 1281后過(guò)表達(dá)let-7 miRNA的sponge，即與miRNA結(jié)合的linc RNA 1281，發(fā)現(xiàn)該實(shí)驗(yàn)可以有效的逆轉(zhuǎn)lincRNA 1281敲除對(duì)分化能力的抑制作用。一系列的表型實(shí)驗(yàn)即當(dāng)過(guò)表達(dá)let-7 sponge后，敲除lincRNA1281的胚胎干細(xì)胞的分化能力增強(qiáng)。當(dāng)然作者也在補(bǔ)充材料里證明let-7/lin28 軸在胚胎干細(xì)胞分化能力中的重要作用。由于先前實(shí)驗(yàn)已有報(bào)道，故在此論文研究中屬于驗(yàn)證性結(jié)果放在補(bǔ)充材料中。

本文主要講了一個(gè)lincRNA 1281對(duì)胚胎干細(xì)胞分化能力起到促進(jìn)作用的故事。

What：lincRNA 1281對(duì)胚胎干細(xì)胞分化能力起到促進(jìn)作用

Why：為什么lincRNA 1281可以促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化能力？作者解釋是因?yàn)閘incRNA 1281發(fā)生了m6A修飾

How：發(fā)生m6A修飾的lincRNA1281是如何促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化能力？作者又設(shè)想了一個(gè)ceRNA 的model，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)證實(shí)。m6A修飾促進(jìn)linc RNA 1281與miRNA let-7家族結(jié)合sponge，那么游離態(tài)的let-7家族數(shù)量就下降，與mRNA lin28（let-7的經(jīng)典底物）的結(jié)合就減少，lin28的轉(zhuǎn)錄后抑制減少，蛋白表達(dá)增加，而lin28是一個(gè)前人實(shí)驗(yàn)證實(shí)的經(jīng)典的促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化的因子。

這是我看的第一篇關(guān)于ceRNA的文章，而且又與lincRNA 的m6A修飾有關(guān)。LincRNA-miRNA-mRNA套路近幾年比較火熱，在轉(zhuǎn)錄后修飾領(lǐng)域研究較為深入，作者又巧妙地將非編碼RNA的m6A修飾引入這套系統(tǒng)里，將兩者結(jié)合的非常好。雖然文章的實(shí)驗(yàn)手段都是比較基礎(chǔ)，但都很經(jīng)典很solid地解釋了問(wèn)題，非常扎實(shí)。無(wú)論是非編碼RNA的m6A修飾（結(jié)合的RIP實(shí)驗(yàn)還是找位點(diǎn)的一些列突變后的RIP實(shí)驗(yàn)），還是ceRNA基本的套路（lincRNA-miRNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)）都做得很扎實(shí)，rescure實(shí)驗(yàn)很完美。兩者結(jié)合又很有新意，我覺(jué)得沒(méi)有什么缺點(diǎn)，我很喜歡，值得學(xué)習(xí)。