挑——差異表達(dá)miRNA篩選

本文首先通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選食管癌差異表達(dá)microRNAs（miRNAs）。作者選用了GSE114110和GSE43732兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析。值得一提的是，作者還利用R語言的limma包對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化處理。作者設(shè)定的閾值為|log2FC|≥ 1和P < 0.05，由圖E和F的火山圖可以看出篩選出的差異表達(dá)miRNAs相比于平時(shí)我們篩選mRNA時(shí)是要相對(duì)少一些的。作者使用的是limma包進(jìn)行的差異表達(dá)分析，使用GEO數(shù)據(jù)庫的在線工具GEO2R也能達(dá)到同樣的目的。篩選到差異基因后，作者使用R語言VennDiagram包制作韋恩圖，使用網(wǎng)站Draw Venn Diagrams （http://bioinformatics.psb./webtools/Venn/）也可做出類似的圖。最終篩選得到3個(gè)上調(diào)的和5個(gè)下調(diào)的miRNAs。

此外再提一句，在分析多個(gè)數(shù)據(jù)集時(shí)，可以將多個(gè)數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)合并分析，但是必須得先去掉批次效應(yīng)。如果不想去進(jìn)行去批次的操作，可以像這篇文章這樣采用取交集的方式，這樣也算是有一定道理的。

聯(lián)——miRNA靶基因預(yù)測

miRTarBase（http://mirtarbase.mbc./php/index.php）是一個(gè)經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的miRNA-靶基因相互作用數(shù)據(jù)庫，作者利用這個(gè)數(shù)據(jù)庫對(duì)8個(gè)差異表達(dá)的miRNA的靶基因進(jìn)行了預(yù)測。3個(gè)上調(diào)的和5個(gè)下調(diào)的hub miRNAs總共分別預(yù)測出468和753個(gè)可能的靶基因。

除了miRTarBase網(wǎng)站外，常用的miRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站還有Targetscan、ENCORI、miRDB、miRWalk等。

圈——miRNA靶基因GO和KEGG富集分析

聯(lián)——PPI網(wǎng)絡(luò)分析得到hub基因，miRNA-hub基因互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

作者又使用STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)預(yù)測出468和753個(gè)可能的靶基因分別作了蛋白蛋白互作（PPI）分析，并進(jìn)一步地利用Cytoscape軟件篩選得到hub基因各10個(gè)。然后對(duì)這20個(gè)基因做了GO和KEGG富集分析。本文作者將GO分析的三大類：生物過程（BP）、分子功能（MF）、細(xì)胞組分（CC）分開展示，并對(duì)靶基因、hub基因分別做富集分析，因此得到的圖比較多。

隨后，作者利用Cytoscape軟件構(gòu)建miRNA-hub基因網(wǎng)絡(luò)。由于miR-196a-5p和miR-1-3p所關(guān)聯(lián)的hub基因最多，作者進(jìn)一步地利用miRNACancerMAP數(shù)據(jù)庫分析了miR-196a-5p和miR-1-3p所涉及的信號(hào)通路。

miRNACancerMAP（http://cis./miRNACancerMAP/）是一個(gè)可以預(yù)測、構(gòu)建癌癥miRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的在線工具，只需點(diǎn)擊網(wǎng)站上方的Quick Search，輸入想要研究的miRNA，即可得到分析結(jié)果。

靠——miRNAs預(yù)后價(jià)值分析

隨后，作者利用利用TCGA數(shù)據(jù)庫、細(xì)胞系以及臨床樣本驗(yàn)證了miR-196a-5p和 miR-1-3p的表達(dá)情況。并利用基于TCGA數(shù)據(jù)的starBase數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-196a-5p和miR-1-3p進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，以評(píng)估其預(yù)后價(jià)值。

到這里其實(shí)這篇文章已經(jīng)可以發(fā)表了，但最新的Aging已經(jīng)不收純生信文章了，要發(fā)5分必須補(bǔ)濕實(shí)驗(yàn)。

干濕結(jié)合的參考組合有：

1、生信 臨床標(biāo)本驗(yàn)證

2、生信 功能表型驗(yàn)證（細(xì)胞或者細(xì)胞 動(dòng)物均可）

3、生信 臨床 功能表型驗(yàn)證

4、生信 臨床 功能 機(jī)制研究

這篇文章運(yùn)用的是“生信 臨床 功能表型驗(yàn)證”組合，作者做了一點(diǎn)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證miR-196a-5p和miR-1-3p對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。所用實(shí)驗(yàn)為CCK-8、EdU和Transwell等常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，比較簡單。這里作者只是用了miRNAmimics做實(shí)驗(yàn)，其實(shí)還可增加使用miRNA inhibitors的實(shí)驗(yàn)。

到此全文就結(jié)束了，總結(jié)一下，作者先用GEO數(shù)據(jù)庫篩選得到食管癌差異表達(dá)miRNAs（挑），然后利用篩選得到的8條miRNAs預(yù)測靶基因（聯(lián)），并對(duì)靶基因進(jìn)行富集分析（圈）；進(jìn)一步地在靶基因中篩選得到hub基因（聯(lián)），并篩出兩條與hub基因聯(lián)系最多的miRNAs（聯(lián)）；最后對(duì)這兩條miRNAs進(jìn)行生存分析，來說明臨床意義（靠），其實(shí)本文還可增加臨床相關(guān)性分析，ROC曲線等分析進(jìn)一步豐富內(nèi)容。此外，這篇文章還增加了一點(diǎn)濕實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容：利用細(xì)胞系和臨床樣本驗(yàn)證兩條miRNA的表達(dá)情況（臨床標(biāo)本驗(yàn)證），并利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)食管癌細(xì)胞增殖遷移能力的影響（功能表型驗(yàn)證）。

整體來說，全文基本全部按照“挑、圈、聯(lián)、靠”的生信套路來進(jìn)行，所用技術(shù)以在線工具為主，適合初學(xué)者模仿。

最后再給大家歸納一下干濕結(jié)合研究套路模板（加粗的是本文所用的方法）：

干：

挑：差異表達(dá)分析篩選目的基因

圈：GO/KEGG富集分析、GSEA富集分析、WGCNA網(wǎng)絡(luò)分析、其他特殊分析（miRNA相關(guān)通路預(yù)測、免疫浸潤等等）

聯(lián)：蛋白蛋白互作（PPI）分析、miRNA交互作用、分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

靠：生存分析、臨床相關(guān)系分析、單因素/多因素分析、差異表達(dá)預(yù)后分析、ROC曲線

濕：

1、臨床標(biāo)本驗(yàn)證（包括細(xì)胞系和臨床樣本）

2、功能表型驗(yàn)證（細(xì)胞或者細(xì)胞 動(dòng)物均可）

3、臨床 功能表型驗(yàn)證

4、臨床 功能 機(jī)制研究

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