eccDNA早在20世紀(jì)60年代就被報道，但2015年才開始在全基因組水平上進行研究。2015年6月，Moller等在PANS發(fā)表了關(guān)于酵母eccDNA的研究，該文章在釀酒酵母（S. cerevisiae）全基因組上共發(fā)現(xiàn)1756個eccDNA（圖1），這些eccDNA分布在不同位點上，覆蓋基因組的23%，包括核糖體基因、轉(zhuǎn)座子殘體和一連串的重復(fù)基因(HXT6/7、ENA1/2/5和CUP1-1/ 2)等，eccDNA的長度在1~38 kb之間，并且80%的eccDNAs包含自主復(fù)制起始位點。根據(jù)釀酒酵母eccDNA在其基因組上分布的豐富性和普遍性，推斷真核基因組中eccDNA很可能與癌癥和其他人類遺傳疾病中的CNV有關(guān)，另外eccDNA還可以通過復(fù)制、刪除和分化推動進化過程。

圖1 eccDNA在酵母基因組上的分布

這篇文章不僅首次在全基因組水平上報道了eccDNA特性和功能，同時還提供了在全基因組水平上研究eccDNA的方法，后續(xù)的很多eccDNA-seq都源自此文章，下面就為大家解析此方法。

本文開發(fā)的Circle-Seq，是基于質(zhì)粒提取、酶切消化和高通量測序的技術(shù)，根據(jù)線性DNA和環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)上的差異，將裂解的細胞通過柱純化、消除線性DNA和滾環(huán)擴增三個主要步驟富集eccDNA，結(jié)合高通量測序獲取eccDNA的信息（圖2）。

圖2  Circle-Seq實驗流程示意圖

為了說明實驗效果，文章中有一系列的質(zhì)控：

質(zhì)控1

三種外源質(zhì)粒pBR322、pUC19、pUG72按照：1:1、1:50、1:2,500(plasmid:cell) 作為spik in加入細胞裂解液中，通過檢測已知質(zhì)粒驗證Circle-Seq技術(shù)的有效性；

圖3 外源質(zhì)粒（已知環(huán)狀DNA元件） 

質(zhì)控2

使用限制性內(nèi)切酶NotI處理樣本后，再利用外切酶消化線性DNA，富集eccDNA，并通過內(nèi)參基因ACT1的定量PCR驗證線性DNA的消除效率；

圖4 核酶外切酶對線性DNA的消除效率

eccDNA鑒定

從mapping到基因組的數(shù)據(jù)中篩選reads連續(xù)覆蓋大于1kb的基因組區(qū)域，并且該區(qū)域內(nèi)測序深度顯著高于其他基因組區(qū)域，該處被認(rèn)為存在eccDNA的區(qū)域（圖6上）；然后通過分析Junction Read（將一條read平均切割成三段，首尾不能同時mapping到參考基因組上的read）進一步鑒定eccDNA（圖6下）。

圖6 生信分析鑒別eccDNA

      除此之外，作者還單獨發(fā)表了詳細的protocl和視頻，供研究人員參考和學(xué)習(xí)。

Protocol鏈接：http://www./video/54239

參考文獻：

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[2] Wu, S., Turner, K.M., Nguyen, N. et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature (2019) doi:10.1038/s41586-019-1763-5

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