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vcf文件是儲存樣本變異信息的文件，如果不采用joint calling的方式進行分析，最終會獲得單個樣本的變異數(shù)據(jù)。為了便于對同組不同樣本進行差異SNP分析，就需要對文件進行合并。vcf文件的合并有很多的軟件可以做，GATK、vcftools和bcftools三款軟件最常用，但是具體的合并方法需要根據(jù)vcf文件中的信息來判斷。 1. 樣本相同、位點獨立的vcf文件合并樣本相同、位點獨立指的是在不同文件中包含的樣本一致，但是彼此之間位點沒有交集，分染色體call變異就是這種類型，可以使用以下的三個方法。1.1 gatk：GatherVcfs|MergeVcfsgatk4提供了兩種vcf文件合并的方法，分別是GatherVcfs和MergeVcfs，兩個方法都是對相同樣本數(shù)據(jù)集的變異結(jié)果進行合并，命令示例如下。# GatherVcfs
gatk GatherVcfs -I concat-a.vcf -I concat-b.vcf -O combine_a_b_samesample_diffsites.vcf
# MergeVcfs
gatk MergeVcfs -I concat-a.vcf -I concat-b.vcf -O combine_a_b_diffsample_allsites_gatk.vcf
兩個命令執(zhí)行結(jié)果完全一致，結(jié)果如下。##fileformat=VCFv4.2
##FILTER=<ID=q10,Description="Quality below 10">
##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Read Depth">
##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description="Genotype Quality">
##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype">
##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Total Depth">
##contig=<ID=1,length=17540695>
##contig=<ID=2,length=14896646>
##contig=<ID=3,length=12399606>
#CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT A
# concat-a.vcf文件位點
1 100 . GTTT G 1806 q10 DP=35 GT:GQ:DP 0/1:409:35
1 110 . C T,G 1792 PASS DP=32 GT:GQ:DP 0/1:245:32
1 120 . GA G 628 q10 DP=21 GT:GQ:DP 1/1:21:21
1 130 . GAA GG 1016 PASS DP=22 GT:GQ:DP 0/1:212:22
1 140 . GT G 727 PASS DP=30 GT:GQ:DP 0/1:150:30
1 150 . TAAAA TA,T 246 PASS DP=10 GT:GQ:DP 1/2:12:10
2 100 . GTTT G 1806 q10 DP=35 GT:GQ:DP 0/1:409:352 110 . CAAA C 1792 PASS DP=32 GT:GQ:DP 0/1:245:32
2 120 . GA G 628 q10 DP=21 GT:GQ:DP 1/1:21:21
2 130 . GAA G 1016 PASS DP=22 GT:GQ:DP 0/1:212:22
2 140 . GT G 727 PASS DP=30 GT:GQ:DP 0/1:150:30
2 150 . TAAAA TA,T 246 PASS DP=10 GT:GQ:DP 1/2:12:10
2 160 . TAAAA TA,TC,T 246 PASS DP=10 GT:GQ:DP 0/2:12:10
# concat-b.vcf文件位點
3 241 . GTTT G 1806 q10 DP=35 GT:GQ:DP 0/1:409:35
3 251 . CAAA C 1792 PASS DP=32 GT:GQ:DP 0/1:245:32
3 261 . GA G 628 q10 DP=21 GT:GQ:DP 1/1:21:21
3 271 . GAA G 1016 PASS DP=22 GT:GQ:DP 0/1:212:22
1.2 vcftools：vcf-concatvcf-concat并不是vcftools的一個子命令，而是軟件安裝目錄下附帶的功能模塊，vcftools安裝完成后可以直接使用，命令如下。/vcftools/bin/vcf-concat concat-a.vcf concat-b.vcf > combine_a_b_samesample_diffsites_vcftools.vcf
在進行較大文件合并時，最好將vcf文件進行壓縮并創(chuàng)建索引，效率會快。如果待合并的vcf文件很多，可以將文件名寫入到一個文件，由參數(shù)-f指定并進行后續(xù)操作。該命令合并完的vcf與gatk結(jié)果一致，只不過表頭信息順序會發(fā)生改變，不影響數(shù)據(jù)使用。1.3 bcftools：concatbcftools軟件在處理vcf文件時，某些情況下會優(yōu)于vcftools，合并vcf文件的命令如下。bcftools concat concat-a.vcf concat-b.vcf -o combine_a_b_samesample_diffsites_bcftools.vcf
合并之后的vcf文件位點信息與其余兩款軟件處理結(jié)果一致，只不過在輸出結(jié)果的header中會出現(xiàn)運行的命令，示例如下。##bcftools_concatVersion=1.3.1+htslib-1.3.1
##bcftools_concatCommand=concat -o combine_a_b_samesample_diffsites_bcftools.vcf concat-a.vcf concat-b.vcf
2. 樣本不同，位點相同或不同這種合并方式主要是對不同樣本的變異文件進行合并，合并時共有位點會進行合并統(tǒng)計，非共有位點若在某一個樣本中沒有變異，則會自動記為缺失。2.1 vcftools:vcf-merge模塊名稱為vcf-merge，在進行merge操作時，會對文件中的位點進行重排，耗時較長。輸入文件需要壓縮后創(chuàng)建索引，示例命令如下。bgzip merge-test-a.vcf.gz && tabix merge-test-a.vcf.gz
bgzip merge-test-b.vcf.gz && tabix merge-test-b.vcf.gz
/vcftools/bin/vcf-merge merge-test-a.vcf.gz merge-test-b.vcf.gz > combine_a_b_diffsamples_allsites_vcftools.vcf
合并之后會對不同文件中的數(shù)據(jù)集進行整合，沒有變異的位點會自動標(biāo)記為缺失。2.2 bcftools:mergebcftools merge merge-test-a.vcf.gz merge-test-b.vcf.gz -o combine_a_b_diffsamples_allsites_bcftools.vcf
該方法也需要預(yù)先對所有vcf文件進行壓縮并創(chuàng)建索引，否則程序無法運行。 2.3 gatk:CombineVariantsgatk3提供了一個CombineVariants可以進行變異數(shù)據(jù)的合并，而gatk4中貌似并沒有相同功能的模塊。CombineVariants使用如下。java -jar /GenomeAnalysisTK-3.8/GenomeAnalysisTK.jar -T CombineVariants -V merge-test-a.vcf -V merge-test-b.vcf -o combine_a_b_diffsample_allsites_gatk.vcf -R ref.fna
#CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT A B
1 3062915 . GTTT G,GT 1806 q10;q20 AC=1,1;AF=0.250,0.250;AN=4;DP=49;set=FilteredInAll GT:DP:GQ 0/1:35:99 0/2:14:99
1 3106154 . CAAAA CA,C 1792 PASS AC=1,1;AF=0.250,0.250;AN=4;DP=47;set=Intersection GT:DP:GQ 0/1:32:99 0/2:15:99
1 3157410 . GA G 628 PASS AC=3;AF=0.750;AN=4;DP=32;set=filterInvariant-variant2 GT:DP:GQ 1/1:21:21 0/1:11:49
1 3162006 . GAA G 1016 PASS AC=2;AF=0.500;AN=4;DP=41;set=Intersection GT:DP:GQ 0/1:22:99 0/1:19:99
1 3177144 . GT G 727 PASS AC=2;AF=0.500;AN=4;DP=54;set=Intersection GT:DP:GQ 0/1:30:99 0/1:24:99
1 3184885 . TAAAA TA,T 246 PASS AC=2,1;AF=0.500,0.250;AN=4;DP=26;set=Intersection GT:DP:GQ 1/2:10:12 0/1:16:99
2 3188209 . GA G 162 . AC=1;AF=0.500;AN=2;DP=15;set=variant2 GT:DP:GQ ./. 0/1:15:99
2 3199812 . G GTT,GT 481 PASS AC=1,1;AF=0.500,0.500;AN=2;DP=26;set=variant GT:DP:GQ 1/2:26:99 ./.
3 3199812 . G GTT,GT 353 PASS AC=1,1;AF=0.500,0.500;AN=2;DP=19;set=variant2 GT:DP:GQ ./. 1/2:19:99
3 3199815 . G A 353 PASS AC=1;AF=0.500;AN=2;DP=19;set=variant2 GT:DP:GQ ./. 0/1:19:99
3 3212016 . CTT C,CT 565 PASS AC=1,1;AF=0.500,0.500;AN=2;DP=26;set=variant GT:DP:GQ 1/2:26:91 ./.
4 3212016 . CTT C 677 q20 AC=1;AF=0.500;AN=2;DP=15;set=FilteredInAll GT:DP:GQ ./. 0/1:15:99
4 3258448 . TACACACAC T 325 PASS AC=1;AF=0.500;AN=2;DP=31;set=variant GT:DP:GQ 0/1:31:99 ./.
需要注意的就是，merge合并之后，不同軟件生成的結(jié)果在數(shù)據(jù)統(tǒng)計上會存在很大的差異，示例如下。# merge-test-a.vcf
1 3184885 . TAAAA TA,T 246 PASS DP=10 GT:GQ:DP 1/2:12:10
# merge-test-b.vcf
1 3184885 . TAAA T 598 PASS DP=16 GT:GQ:DP 0/1:435:16
# combine_a_b_diffsamples_allsites_vcftools.vcf
1 3184885 . TAAAA TA,T 422.00 PASS AC=2,1;AN=4;DP=26;SF=0,1 GT:DP:GQ 1/2:10:12 0/1:16:435
# combine_a_b_diffsamples_allsites_bcftools.vcf
1 3184885 . TAAAA TA,T 598 PASS DP=26 GT:GQ:DP 1/2:12:10 0/1:435:16
從上面的實例可以看出，在合并過程中需要重新輸出分型質(zhì)量，vcftools會對統(tǒng)計結(jié)果進行平均取值，bcftools取其中的最大值輸出，而gatk會取最小值輸出，并且gatk和vcftools在原有統(tǒng)計數(shù)據(jù)基礎(chǔ)之上，還會重新計算AC、AN等指標(biāo)。
對于vcf數(shù)據(jù)合并，由于不同樣本發(fā)生的變異很難保證一致，所以在合并不同樣本的數(shù)據(jù)時，結(jié)果往往具有很高的缺失率，后續(xù)的差異分析實質(zhì)上只是對不同樣本的共有位點進行分析，丟失了某些樣本或群體的特有變異位點。為了避免這種情況，多樣本差異分析的項目最好是用joint calling進行變異檢測，能獲得更多的位點。3. 猜你喜歡4. 參考文件[1] https://gatk./hc/en-us/articles/360046221931-GatherVcfs-Picard-
[2] http://samtools./bcftools/bcftools.html#concat
[3] https://gatk./hc/en-us/articles/360045800732-MergeVcfs-Picard-
[4] https://vcftools./man_latest.html#如有錯誤，歡迎指正#
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