題目：Proteomic Analyses of Human Regulatory T Cells Reveal Adaptations in Signaling Pathways that Protect Cellular Identity（人調(diào)節(jié)T細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示其在保護細胞信號通路中的適應(yīng)性）

期刊：Immunity

影響因子：19.734

主要技術(shù)：轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組

研究背景

        Treg cells（調(diào)節(jié)性T細胞）因其轉(zhuǎn)錄因子FOXP3的表達和抑制免疫應(yīng)答的能力構(gòu)成了獨特的CD4+T細胞譜系。Treg 細胞可以保護免疫耐受，抑制免疫細胞造成的組織損傷，促進組織修復(fù)。Treg細胞也有不好的一面，它可以阻礙機體對癌細胞的免疫能力，有研究認為Treg這部分的功能缺失可能是造成人類自身免疫疾病和過敏發(fā)生的基礎(chǔ)。因此，需要有針對性的促進或抑制人類疾病中的Treg細胞功能。Treg細胞和Tconv細胞密切相關(guān)，作者希望能夠在分子水平上對二者進行詳細研究和區(qū)分。

研究內(nèi)容及結(jié)果

1. Treg細胞蛋白表達特征

        作者從健康人供體的外周血單核細胞（PBMCs）分離CD4 + T細胞亞群。這些細胞亞群包含nTconv細胞（CD45RA + CD25-）、記憶（m）Tconv細胞（CD45RA-CD25-）、nTreg細胞（CD45RA+CD25hi）和eTreg細胞（CD45RA-CD25hi）（圖1A）。兩種Treg細胞亞群都表達FOXP3和Helios并且缺乏IL-7受體α鏈（CD127），而nTconv和mTconv細胞亞群則相反，它們?nèi)狈OXP3和Helios，但是能表達CD127。使用高分辨率質(zhì)譜（MS），作者鑒定了平均35,744±3,757個肽段，5,955±344個蛋白gurup。在所有五個CD4+T細胞亞群中定量了4,358種不同的蛋白質(zhì)。其中，422種蛋白質(zhì)基于其非標記定量（LFQ）值在CD4+T細胞亞群中表現(xiàn)出差異表達（FDR <0.05）。 總數(shù)據(jù)集的主成分分析（PCA，圖1B）、Pearson相關(guān)分析（圖1C）、差異表達蛋白的層次聚類（圖1D）證實了生物重復(fù)的密切相關(guān)性。作者分離CD4+T細胞亞群的原則并不是基于細胞譜系，而是根據(jù)CD45RA的表達（圖1D）。富集分析顯示，幼稚Treg和Tconv細胞共享參與磷酸戊糖代謝、NADP代謝和染色質(zhì)組織等過程中的過表達蛋白（圖1D），而eTreg和mTconv細胞共享參與蛋白質(zhì)合成、細胞運輸、信號傳導(dǎo)和凋亡的過表達蛋白（圖1D）。基于分化階段蛋白質(zhì)表達的相似性可部分反映淋巴組織（幼稚細胞）與非淋巴組織（效應(yīng)細胞）的優(yōu)先定位。從聚類結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)具體的Treg細胞蛋白特征，如nTreg和eTreg細胞共享某些高表達蛋白（cluster1）和低表達蛋白（cluster9-10），而eTreg細胞則獨自表現(xiàn)出在cluster2中蛋白高表達以及在cluster6中蛋白低表達。

圖1  CD4+T細胞亞群蛋白組學(xué)結(jié)果

2. Treg細胞的mRNA表達特征

        Treg細胞的蛋白組學(xué)結(jié)果與已發(fā)表的相似的細胞亞群的轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果關(guān)聯(lián)性較低。為了進行直接比較，作者對五個CD4+T細胞亞群進行了全基因組mRNA深度測序。也基于它們的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，nTreg和nTconv細胞聚集在一起并遠離三種效應(yīng)和記憶表型CD4+T細胞群（圖2A）。在五個CD4 + T細胞亞群（圖2B）之間總共649個差異表達mRNA（p <0.05），包括預(yù)期的標志基因如IL-7R、IKZF2（HELIOS）和效應(yīng)細胞因子。作者分析發(fā)現(xiàn)，eTreg細胞的mRNA表達特征既有特異性（圖2B，cluster7;），也有和其他Treg細胞的一致的共性，如都可以表達FOXP3、IL2RA、TIGIT等分子（圖2B和2C，cluster6）。已經(jīng)發(fā)表的文章結(jié)果也證明了作者的發(fā)現(xiàn)。作者發(fā)現(xiàn)，Treg細胞蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中只有三個分子（FOXP3，SHMT2和SWAP70）表達量趨勢上發(fā)生重疊（圖2F）。事實上，553 個mRNA和409個蛋白質(zhì)在五個CD4+ T細胞亞群之間顯著差異表達，并且可以在兩個水平上定量，但是二者僅重疊48個（圖2G）。因此，與眾多報道的文獻結(jié)果一致，相對于轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，蛋白質(zhì)組學(xué)會獲得明顯不同的結(jié)果（穩(wěn)定狀態(tài)下分析的細胞中）。

圖2  CD4+ T細胞亞群mRNA表達結(jié)果

3. 蛋白質(zhì)水平與mRNa水平的區(qū)別

        為了定量比較蛋白質(zhì)和mRNA水平，作者使用基于強度的絕對定量分析蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)（iBAQ）。發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)和mRNA的豐度水平都超過五個數(shù)量級（圖3A和3D）。在蛋白水平中，豐度最高的是核糖體和代謝蛋白（圖3B），在mRNA水平中，豐度最高的是編碼參與（免疫）細胞、信號傳導(dǎo)和功能的核糖體組分和分子（圖3E），差異蛋白的豐度通常要比mRNA要高。

        作者對4792個mRNA-protein對的表達量在轉(zhuǎn)錄組和蛋白組水平上進行定位，發(fā)現(xiàn)其相關(guān)系數(shù)約為0.44±0.01。422種差異表達的蛋白質(zhì)中，在mRNA水平檢測到409種，并進行定量比較（圖3G）。雖然蛋白質(zhì)和mRNA表達水平通常相關(guān)（例如，F(xiàn)OXP3I、KZF2），但是大多數(shù)僅有一種（蛋白或mRNA）的表達量達到差異統(tǒng)計標準，這就解釋了差異表達的蛋白質(zhì)和mRNA之間的有限重疊（圖2F）。作者發(fā)現(xiàn)一些分子僅在mRNA或蛋白質(zhì)水平上真正差異表達（圖3H），這說明細胞調(diào)節(jié)具有一定的層次范圍。例如，對于FTH1（圖3G），是一個已知在嚴格的翻譯控制下的蛋白質(zhì)（Hentze等人，2010），它在nTreg和eTreg細胞中豐度都很高；STAM2在mTconv細胞中雖然mRNA水平低，但是蛋白豐度很高（圖3G）, 另一方面，在nTreg和eTreg細胞中，mRNA上高表達但蛋白質(zhì)水平并不高（圖3G）。

        作者認為聯(lián)合蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組分析可以增加對通路分析的可信度。這樣的組合數(shù)據(jù)有力地論證了與其他CD4+ T細胞亞群相比，核因子kB（NF-kB）和JAK-STAT途徑在eTreg細胞中更容易脫敏（圖3I）?？傊溲芯拷Y(jié)果強調(diào)了蛋白質(zhì)組學(xué)分析對細胞類型功能表征的重要性。

圖3  mRNA和蛋白表達的通路富集分析結(jié)果

4. Treg細胞具有穩(wěn)定的蛋白質(zhì)特征

        作者定義的常見Treg細胞特征由22個具有較高表達的蛋白質(zhì)和29個低表達蛋白質(zhì)組成（圖4A）。 免疫印跡和流式細胞術(shù)證實了這些蛋白質(zhì)中的8種蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。 在早期的Treg細胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，多是基于CD4+CD127-CD25+和CD4+CD127+ CD25-細胞，覆蓋的蛋白質(zhì)組較少，所以并沒有找到類似作者發(fā)現(xiàn)的組學(xué)特征。常見的Treg細胞特征包括FOXP3、IKZF2（Helios）、代謝蛋白GK、UGP2和SHMT2、鐵儲存蛋白鐵蛋白重鏈和輕鏈（FTH1，F(xiàn)LT），以及溶酶體蛋白ASAH1、GGH、GUSB、SGSH和PLBD2，與Tconv細胞相比，它們都在Treg中以高豐度表達（圖4A和4B）。 該特征還包括糖酵解酶HK1、ME2、脂肪酸氧化酶AP00和線粒體脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白（CPT1A），與Tconv細胞相比，均在Treg中以低豐度表達。作者發(fā)現(xiàn)許多信號分子在常見的Treg細胞特征中是差異表達的，如脫氫泛素酶OTULIN的高表達，TNFα誘導(dǎo)的NF-kB活化的抑制劑和TNFRSF1A接頭TRADD的低表達（圖4A和4B），以及mRNA水平的TNFRSF1B的高表達，表明Treg細胞在TNFR信號傳導(dǎo)中表現(xiàn)出適應(yīng)性。脂質(zhì)磷酸酶INPP5D（SHIP-1）的高表達抑制PI3K-AKT信號傳導(dǎo)，mTOR活化劑RPS6KA1和RPS6KA3的低表達，同樣也表明PI3K / AKT / mTOR途徑的適應(yīng)性，Treg細胞中STAT4和NFATc2的低表達突出。
 

        為了確定上文鑒定的蛋白質(zhì)表達模式的穩(wěn)定性，作者在體外T細胞擴增后進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。通過CD3、CD28和IL-2刺激將nTreg和nTconv細胞在體外擴增2周，孵育4天，并通過FOXP3、Helios、CTLA-4和CD25染色以及FOXP3基因TSDR甲基化驗證它們的身份。值得注意的是，即使在通過CD3和CD28途徑重新激活后，Treg細胞核心特征中大多數(shù)蛋白質(zhì)特異性表達模式也基本上是保守的（圖4C，4D）。作者認為Treg細胞在某些代謝功能以及重要信號通路的組成中與Tconv細胞本質(zhì)上不同。

圖4  常見的Treg細胞蛋白組學(xué)特征

5. eTreg細胞特有的蛋白組學(xué)特征

        除了常見的Treg細胞特征外，作者發(fā)現(xiàn)eTreg細胞與其他CD4+ T細胞亞群相比有獨特的蛋白質(zhì)簇表達特征：具有相對高的（eTreghi）和低的（eTreglo）表達（圖5A）。eTreghi簇包括參與DNA復(fù)制（MCM2，-3，-4，-6，-7，F(xiàn)EN1）、有絲分裂（CORO1C，TUBA1B，TUBB，MYH9）（圖5A和5B）和細胞凋亡（FAS，CASP3）的蛋白質(zhì)，這和已有研究一致，說明這些細胞正在發(fā)生分裂。在eTreghi簇中的41種蛋白質(zhì)中，17種在體外Treg細胞擴增后仍顯示出上升趨勢，其中5種達到統(tǒng)計學(xué)顯著性。同樣，eTreglo簇中39種蛋白中的25種在體外擴增的Treg細胞中保持低表達。eTreglo簇包含多種調(diào)節(jié)細胞凋亡敏感性的GIMAP（圖5A和5B）。重要的是，eTreglo簇中幾乎40％的蛋白質(zhì)在細胞信號傳導(dǎo)中具有功能，它們包括NF-kB途徑的多種成分（PRKCB、DPP4、NF-kB1、NF-kB2）、細胞因子受體途徑（IL-7R、INPP4B、STAM2、STAT3）和TCR途徑（TRAT1、VAV1、THEMIS）。即使在體外培養(yǎng)之后，Treg細胞中許多蛋白質(zhì)的表達相對較低，表明這種對信號通路的明顯脫敏作用，并不僅僅是通過這些通路在體內(nèi)激活信號的負面反饋調(diào)節(jié)。

        FOXP3可以與關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（如IL17A和IL4）發(fā)生物理相互作用并且具有可以淬滅它們反式激活Tconv細胞效應(yīng)基因的能力。反之亦然，如YY1的因子可以抑制FOXP3介導(dǎo)的Treg細胞程序的控制。作者為了確定Treg細胞中FOXP3的相對濃度是否足以“壓倒”這樣的相互作用因子，使用蛋白質(zhì)組學(xué)標尺方法確定了每個細胞的蛋白質(zhì)拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)FOXP3在eTreg細胞中的拷貝數(shù)超過其許多伴侶蛋白，其中差別最大的是轉(zhuǎn)錄因子，如NFATc1和STAT4（圖5 C）。然而，對于一些轉(zhuǎn)錄因子（YY1、RUNX1和NFATc2），F(xiàn)OXP3過量僅為2至3倍，這可以解釋為什么FOXP3的適度減少允許Treg細胞產(chǎn)生效應(yīng)細胞因子。最后，作者發(fā)現(xiàn)mTconv細胞中FOXP3的表達水平可能不足以有效中和其伴侶轉(zhuǎn)錄因子（圖5C）。

圖5  eTreg細胞蛋白特征

6. eTreg細胞具有效應(yīng)基因表達的遲鈍途徑

        作者發(fā)現(xiàn)與Tconv細胞相比，eTreg細胞的IPA分析顯示TCR、模式識別受體（PRR）、細胞因子受體和TNFRSF家族誘導(dǎo)的NF-κB途徑信號傳導(dǎo)具有適應(yīng)性。此外，通過NF-kB1和NF的流式細胞術(shù)證實，eTreg細胞中NF-kB1（p50）、NF-kB2（p52）和RELA（p65）的mRNA水平較低。因此，在eTreg細胞中，NF-kB1的反cd3和反cd28誘發(fā)的核核易位被削弱了，但在nTreg細胞中卻沒有。NFATc1和NFATc2蛋白水平在nTreg細胞和eTreg細胞中都較低。此外，NFATc2在普通Treg細胞的蛋白中含量較低，在Treg細胞在體外（圖4A和4D）后保持低表達。最后，在eTreg細胞轉(zhuǎn)錄組（圖6A）中，帶有NFATc2綁定元素的基因含量降低（圖6A），這表明該因素在體內(nèi)的這些細胞中不那么活躍。

        炎性細胞因子控制Treg細胞行為可能會對其穩(wěn)定性造成影響，在傳遞細胞因子受體信號的STAT轉(zhuǎn)錄因子中，STAT3、STAT6，尤其是STAT4在eTreg細胞中表現(xiàn)出低表達。STAT4表達在mRNA和蛋白質(zhì)水平均較低，STAT4的低蛋白質(zhì)表達是常見Treg細胞蛋白特征的一部分。在eTreg細胞轉(zhuǎn)錄組中，帶有STAT4結(jié)合元素的基因也沒有得到充分的表達（圖6A），這支持了體內(nèi)eTreg細胞中STAT4活性降低的觀點。通過響應(yīng)IL-12和I型IFN磷酸化Y693，在人CD4 + T細胞中激活STAT4，后者在人CD4 + Tconv細胞中誘導(dǎo)最強的早期STAT4磷酸化。這些細胞因子一致地誘導(dǎo)Treg細胞中STAT4的磷酸化比從血液中新鮮分離的Tconv細胞中更少（圖6C），并且這種差異在體外擴增的細胞中甚至更為顯著（圖6E）。STAT4是IFNg基因表達的主要調(diào)節(jié)因子，因此，作者推斷STAT4的低表達可能使Treg細胞與炎性細胞因子誘導(dǎo)IFN-g隔離。與此假設(shè)一致，IFN-α并且IL-12不能在Treg細胞中誘導(dǎo)IFN-g產(chǎn)生（圖6F）。然而，當(dāng)故意過表達STAT4時，這些細胞因子確實激發(fā)了IFN-g的產(chǎn)生Treg細胞（圖6G）。值得注意的是，尤其是當(dāng)用IFN-α或IL-12刺激Treg細胞時，STAT4的過表達也誘導(dǎo)了IL-2的產(chǎn)生（圖6G）和FOXP3表達的顯著喪失（圖6H和6I）。這些發(fā)現(xiàn)表明STAT4的低表達有助于在炎性環(huán)境中保護Treg細胞。

        因為Treg細胞需要來自炎性細胞因子的輸入，所以雖然STAT4表達低，但是作者仍驗證了Treg細胞是否能夠?qū)型IFN起反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Treg和Tconv細胞中均等地誘導(dǎo)STAT1磷酸化（圖6B和6D）。 此外，IFN-α容易在抗CD3和抗CD28活化的Treg細胞中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子T-bet和趨化因子受體CXCR3的表達（圖6J，6K）。 總之，這些發(fā)現(xiàn)表明STAT4的選擇性低表達允許Treg細胞響應(yīng)炎性細胞因子（例如歸巢至發(fā)炎組織），而不損害Treg細胞。

圖6  Treg細胞中選擇性缺乏STAT4激活

7. 在Fr.III細胞中可以區(qū)分不同的細胞群

        Fr.III細胞是CD4+CD25+并且表達FOXP3，可以產(chǎn)生炎性細胞因子并且在體外缺乏強大抑制能力的細胞。該群體中的許多細胞表達CD127表明它是含有類似Treg或Tconv細胞的細胞的混合群體。為了更好地表征這一群體，作者根據(jù)CD127是否表達將其分成兩個部分，然后進行每個級分的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并與nTconv、mTconv、nTreg和eTreg細胞的蛋白質(zhì)組一起進行分析。層次聚類分析和PCA顯示CD127+ 亞群與mTconv細胞密切相關(guān)（圖7A和7B），說明CD127用于區(qū)分Tconv和Treg細胞有用性。值得注意的是，CD127- 亞群與eTreg細胞幾乎無法區(qū)分。CD127- Fr.III和eTreg細胞之間的緊密蛋白質(zhì)組關(guān)系表明前者可能是真正的Treg細胞群，然而，F(xiàn)OXP3中的TSDR在CD127- Fr.III細胞中比在eTreg細胞中更加甲基化（圖7C）。此外，CD127-Fr.III細胞含有大部分產(chǎn)生一種或多種效應(yīng)細胞因子的細胞（圖7F），這與eTreg細胞不同，因為eTreg細胞大多缺乏這種能力。

        并非CD127- Fr.III群體中的所有細胞都產(chǎn)生效應(yīng)細胞因子，也并非eTreg細胞群中的所有細胞都缺乏產(chǎn)生此類細胞因子的能力，這表明即使這些明確定義的細胞群體仍可能是異質(zhì)的。因此，作者在蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集中搜索了可能有助于區(qū)分具有不同功能特性的細胞的標記物。之前已有研究報道，在Treg細胞上發(fā)現(xiàn)的兩種標記物與陽性（CD49d）或陰性（CCR4）標志物與群體產(chǎn)生效應(yīng)細胞因子的相對能力相關(guān)（圖7D）。流式細胞術(shù)分析顯示這些標志物表現(xiàn)出互斥的表達模式（圖7E），eTreg細胞群中產(chǎn)生IL-2或IL-17的少數(shù)細胞在表達CD49d的細胞中最為突出，這和已有的報道結(jié)果一致。然而，僅CD49d-CCR4 +表型完全排除了完全產(chǎn)生效應(yīng)細胞因子的eTreg細胞（圖7G）。在CD127-Fr.III群體中觀察到類似的趨勢，其中CD49d-CCR4 +群體中不存在產(chǎn)生IL-17和IFN-g的細胞。然而，該群體在產(chǎn)生IL-2的能力方面仍然不同于相應(yīng)的CD49d-CCR4 + eTreg細胞亞群（圖7G）。FOXP3的相對蛋白水平與每個群體中產(chǎn)生細胞因子的細胞的比例成反比。因此，F(xiàn)OXP3表達逐漸從eTreg細胞（最高）降低至Fr.III CD127-和Fr.III CD127 +（最低，但仍然高于mTconv細胞）。此外，在每個群體中，CCR4+CD49d-細胞總是表達比CCR4-CD49d +細胞更高的FOXP3。最后，TSDR僅在eTreg細胞中完全去甲基化，并且主要在CD127-CCR4+CD49d-Fr.III細胞中甲基化，其僅產(chǎn)生IL-2，但不產(chǎn)生其他炎性細胞因子。

        因此，作者的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)使其發(fā)現(xiàn)CCR4和CD49d區(qū)分具有不同能力的細胞，以在eTreg細胞和Fr.III群體內(nèi)產(chǎn)生效應(yīng)細胞因子。這些標記物與常用的Treg細胞標記物組合的組合可用于細胞純化和診斷目的。例如，它們有助于闡明腫瘤中FOXP3+ CD4+T細胞的存在與患者愈后之間的關(guān)聯(lián)，特別是對于癌癥如結(jié)腸癌等。

圖7  蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了Fr.iii和eTreg細胞之間的功能異質(zhì)性

文章小結(jié)

        通過對人類調(diào)節(jié)和常規(guī)CD4+T（Tconv）細胞的各種群體進行蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)，獲得調(diào)節(jié)性T（Treg）細胞特性的分子特征，鑒定并定義了所有Treg細胞的蛋白質(zhì)表達特征，以及定義效應(yīng)Treg細胞的獨特特征。發(fā)現(xiàn)了Treg細胞中的代謝特征，以及細胞因子、TCR和共刺激受體信號傳導(dǎo)途徑的特異性適應(yīng)性：適應(yīng)——選擇性STAT4缺陷——保護Treg細胞穩(wěn)態(tài)模型，該途徑通過炎性細胞因子起作用，而這些信號仍然可以通過其他途徑誘發(fā)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子和引導(dǎo)受體。此外，作者的研究揭示了識別具有不同功能特性的FOXP3+ CD4+T細胞的表面標志物。作者的研究結(jié)果表明，信號通路中的適應(yīng)性保護Treg細胞，并為進一步研究Treg細胞生物學(xué)提供了資源。

解析文獻

Eloy Cuadrado, Maartje van den Biggelaar, et al. Proteomic Analyses of Human Regulatory T Cells Reveal Adaptations in Signaling Pathways that Protect Cellular Identity. Immunity, 2018. 
 

參考文獻

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