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研究簡介 病毒在健康新生兒腸道中的定植通常發(fā)生在出生之后，而在后續(xù)不同的環(huán)境下，有些病毒的定植會引發(fā)新生兒腸道疾病。在過去的數(shù)十年中，母乳喂養(yǎng)對嬰兒健康的益處在眾多研究中得以證明，如增強免疫力、提升智力、減少兒童期肥胖和減少罹患過敏性疾病的幾率等，但是對母乳喂養(yǎng)影響嬰兒生長與健康的機制仍然知之甚少。 2020年4月15日賓夕法尼亞大學(xué)佩雷爾曼醫(yī)學(xué)院 Frederic D. Bushman教授研究團隊在Nature上發(fā)表了題為The stepwise assembly of the neonatal virome is modulated by breastfeeding的研究性論文，該研究揭示了新生兒病毒群落的組裝是分步進(jìn)行的，通過母乳喂養(yǎng)可以調(diào)節(jié)新生兒病毒的逐步組裝，抑制病毒在人體細(xì)胞中的定植與發(fā)展。
研究結(jié)果： 首先為了研究新生兒體內(nèi)早期的病毒，研究團隊收集了20名健康嬰兒不同階段的糞便樣本。通過顆粒富集和SYBR染色，觀察到出生后的11-152小時內(nèi)，17/20的新生兒糞便樣本中還檢測不到病毒樣顆粒（圖1a）；而1個月大時，大多樣本中已經(jīng)都能檢測到，且每克樣本中病毒樣顆粒數(shù)多達(dá)1.6 × 109；4個月大時情況相似。作為對照，研究團隊還檢測了122名5歲兒童糞便樣本中的病毒樣顆粒數(shù)量，發(fā)現(xiàn)與嬰兒時期差別不大（圖1b）。研究團隊因此推測，嬰兒在1個月時的腸道病毒數(shù)量通常會持續(xù)到成年期。 為了確定病毒的來源，研究團隊首先對糞便樣本中的微生物進(jìn)行了16s qPCR檢測以確定糞便樣本中細(xì)菌總體含量。結(jié)果顯示，0個月時，14/20的新生兒糞便樣本中的檢測不到或檢測極低含量的16s rRNA，而另外6個樣本中的16s rRNA copy數(shù)量也只為3.3×106/克（糞便）；而在1個月和4個月樣本中，細(xì)菌DNA已經(jīng)占主導(dǎo)地位，到達(dá)3.1×108/克（圖1c）。通過宏基因組測序，新生兒樣本多為人類基因組DNA，1個月和4個月樣本中，細(xì)菌的豐度和多樣性很高。更重要的是，通過對病毒顆粒中DNA與RNA病毒的測序。嬰兒1個月大時，檢測到病毒種類也開始增加，能夠識別到大多病毒樣顆粒為噬菌體家族（可以感染細(xì)菌的病毒）（圖1d和1e），4個月大時，真核病毒（Adenoviridae, Anelloviridae, Caliciviridae和Picornaviridae.）變得更為顯著（圖1e）。在這里，由于腸道噬菌體在全部噬菌體中占比很少，而噬菌體是腸道病毒組的主要構(gòu)成。為了增加比對的精確度，研究團隊將測序reads組裝為contigs，并將contig內(nèi)的一半閱讀框注釋為該contig可注釋到的病毒。隨后通過對細(xì)菌和病毒的豐度與多樣性的關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，兩者直接有著很強的相互作用。
圖1：嬰兒腸道樣本中病毒顆粒的檢測與特征。 噬菌體的復(fù)制方式分為溶解模式或溶原模式（詳見病毒組系列2）。之前有研究證明，嬰兒的腸道噬菌體與成人相比較，溶解模式為主導(dǎo)地位。為了進(jìn)一步對噬菌體復(fù)制方式以及噬菌體和病毒樣顆粒基因進(jìn)行探索，研究團隊將從樣本中分離24株細(xì)菌，其中包括3株Escherichia coli, 3株Klebsiella和10株Enterococcus，后用同源的病毒顆粒進(jìn)行感染。結(jié)果發(fā)現(xiàn)并沒有噬菌體斑形成，說明嬰兒腸道噬菌體并不是溶解模式。通過PHACTS（基于隨機森林對噬菌體復(fù)制方式的分類方法）對病毒顆粒DNA的contigs分析，發(fā)現(xiàn)大部分基因組更傾向于比對到溫和噬菌體，而非烈性噬菌體。研究團隊又對上述24株細(xì)菌別進(jìn)行了有氧和無氧的培養(yǎng)，用裂絲霉素C誘導(dǎo)不同條件下的細(xì)菌后，重新富集病毒顆粒，并染色觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，裂絲霉素C誘導(dǎo)后，80%的菌株釋放了病毒顆粒，而刺激前只有32%（圖2a）。無論從基因數(shù)據(jù)還是微生物實驗都證明誘導(dǎo)可刺激嬰兒的腸道細(xì)菌釋放更高水平的病毒顆粒。 為了進(jìn)一步驗證誘導(dǎo)所產(chǎn)生的病毒顆粒是否來源已整合到細(xì)菌宿主DNA上的原噬菌體，研究團隊又對上述24株細(xì)菌和誘導(dǎo)前后這24株細(xì)菌分別釋放出的病毒顆粒進(jìn)行基因組測序。通過對兩者的比較發(fā)現(xiàn)很高的同源性。而后對比來自純化細(xì)菌的病毒顆粒和糞便病毒顆粒數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)同源樣本具有很高的一致性。此外特定菌株在腸道菌群中的豐度與其源噬菌體在病毒組中的豐度成正相關(guān)（圖2b、2c和2d）。 crAssphages以Bacteroides為宿主，在復(fù)制中并不整合到宿主基因組中。在1月大的樣本中，crAssphages豐度極低，而在4月大嬰兒及2-5歲兒童的腸道中卻普遍存在。這證明該烈性噬菌體主要在出生后期出現(xiàn)，其原因或許是需要“先鋒細(xì)菌” Bacteroides先定植于腸道。 至此，上述研究發(fā)現(xiàn)“先鋒細(xì)菌”首先在嬰兒腸道內(nèi)定植，隨后噬菌體作為病毒組的主要成分，定植于腸道。
圖2：原噬菌體（Prophage）作為生命早期腸道病毒組的主要成分 為了了解病毒定植的影響因素，研究團隊將來自這20例嬰兒的糞便樣本病毒數(shù)據(jù)與喂養(yǎng)史、出生方式和性別等因素進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)母乳喂養(yǎng)有很強的影響，與可在人體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的病毒的積累量較低有關(guān)。覆蓋33%病毒基因組的檢測結(jié)果顯示，僅在以配方奶喂養(yǎng)的嬰兒樣本中發(fā)現(xiàn)了可感染人細(xì)胞的病毒（圖3a）。 為了驗證這一發(fā)現(xiàn)，研究團隊分析了額外125名嬰兒在3-4個月大時的糞便樣本的宏基因組數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，30%喝配方奶的嬰兒的糞便樣本中可檢測到人體病毒。相比之下，純母乳喂養(yǎng)或混合喂養(yǎng)的嬰兒中，這一比例僅為9%。該結(jié)果通過對Adenovirus、Torque teno virus、Enterovirus、Astroviridae、Sapovirus和Norovirus的qPCR數(shù)據(jù)得以驗證（圖3b）。在100例非洲新生兒樣本中，qPCR結(jié)果再次得到印證。這提示該現(xiàn)象可能廣泛存在（圖3b）。 此外，對配方奶進(jìn)行病毒純化和分析，也未檢測到可感染動物細(xì)胞的病毒，表明這些病毒不太可能源于配方奶的污染。 進(jìn)一步分析表明，喂養(yǎng)方式也影響了病毒種類。母乳喂養(yǎng)嬰兒糞便樣本中能檢測到有較高水平的雙歧桿菌（Bifidobacterium）和乳酸桿菌（Lactobacillus），以此為宿主的病毒（噬菌體）基因序列也更豐富（圖3c和3d）。
圖3：母乳喂養(yǎng)對嬰兒腸道病毒定植的影響 結(jié)論： 總結(jié)來看，這些發(fā)現(xiàn)表明，嬰兒出生后，其腸道內(nèi)的病毒定植過程或許受到母乳喂養(yǎng)的調(diào)控。病毒定植分階段發(fā)生：第一階段主要是“先鋒細(xì)菌”定植后引入噬菌體，在第二階段，可感染人類細(xì)胞的病毒定植，而第二階段與喂養(yǎng)方式有關(guān)。這項研究加深了對于母乳喂養(yǎng)保護作用的理解，同時強調(diào)了潛在干預(yù)或可減少嬰兒感染（圖3e）。 參考文獻(xiàn)： Guanxiang Liang, et al., (2020). The stepwise assembly of the neonatal virome is modulated by breastfeeding. Nature, DOI: 10.1038/s41586-020-2192-1 文中病毒組研究方法： 1. 病毒顆粒富集： 200mg糞便樣本于SM緩沖液中勻漿，離心后過0.2μm濾膜。濾液用100-kDa-molecular-mass Amicon Ultra-15 離心濾膜濃縮。30ml重懸后離心，濃縮到500μl。 2. 數(shù)據(jù)庫：UniProt Knowledgebase（TrEML和Swiss-Prot）中的病毒蛋白數(shù)據(jù)庫；NCBI nt數(shù)據(jù)庫。  |
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