原核細(xì)胞有3種DNA聚合酶，都與DNA鏈的延長(zhǎng)有關(guān)。DNA聚合酶I是單鏈多肽，可催化單鏈或雙鏈DNA 的延長(zhǎng)；DNA聚合酶II則與低分子脫氧核苷酸鏈的延長(zhǎng)有關(guān)；DNA聚合酶III在細(xì)胞中存在的數(shù)目不多，是促進(jìn)DNA鏈延長(zhǎng)的主要酶。功能

[1]聚合作用:在引物RNA'-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個(gè)將核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的專一性主要表現(xiàn)為新進(jìn)入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對(duì)時(shí)才有催化作用。dNTP進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，促進(jìn)3'-OH與5'-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵。若是錯(cuò)誤的核苷酸進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)，則不能與模板配對(duì)，無(wú)法改變酶的構(gòu)象而被3'-5'外切酶活性位點(diǎn)所識(shí)別并切除之。

[2]3'→5'外切酶活性——校對(duì)作用:這種酶活性的主要功能是從3'→5'方向識(shí)別和切除不配對(duì)的DNA生長(zhǎng)鏈末端的核苷酸。當(dāng)反應(yīng)體系中沒(méi)有反應(yīng)底物dNTP時(shí)，由于沒(méi)有聚合作用而出現(xiàn)暫時(shí)的游離現(xiàn)象，從而被3'→5'外切酶活性所降解。如果提高反應(yīng)體系的溫度可以促進(jìn)這種作用，這表明溫度升高使DNA生長(zhǎng)鏈3'末端與模板發(fā)生分離的機(jī)會(huì)更多，因而降解作用加強(qiáng)。當(dāng)向反應(yīng)體系加入dNTP，而且只加放與模板互補(bǔ)的上述核苷酸才會(huì)使這種外切酶活性受到抑制，并繼續(xù)進(jìn)行DNA的合成。由此推論，3'→5'外切酶活性的主要功能是校對(duì)作用，當(dāng)加入的核苷酸與模板不互補(bǔ)而游離時(shí)則被3'→5'外切酶切除，以便重新在這個(gè)位置上聚合對(duì)應(yīng)的核苷酸。在某些T4噬菌體突變株中DNA復(fù)制的真實(shí)性降低，而易發(fā)生突變，從此突變株分離得到的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性很低。相反，另外一些具有抗突變能力的T4突變株中的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA復(fù)制真實(shí)性好，變異率低。可見(jiàn)，3'→5'外切酶活性對(duì)DNA復(fù)制真實(shí)性的維持是十分重要的。

[3]5'→3'外切酶活性——切除修復(fù)作用:5'→3'外切酶活性就是從5'→3'方向水解DNA生長(zhǎng)鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5'-脫氧核苷酸。這種酶活性只對(duì)DNA上配對(duì)部份(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是5'→3'。每次能切除10個(gè)核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力達(dá)10倍以上。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起著重要作用。對(duì)岡崎片段5'末端RNA引物的去除依賴此種外切酶活性。

[4]焦磷酸解作用:DNApolⅠ的這種活性可以催化3'末端焦磷酸解DNA分子。這種作用就是無(wú)機(jī)焦磷酸分解DNA生長(zhǎng)鏈，可以認(rèn)為是DNA聚合作用的逆反應(yīng)，而且這種水解DNA鏈作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi←(dNMP)n-x+X(dNPPP)→DNA

[5]焦磷酸交換作用:催化dNTP末端的PPi同無(wú)機(jī)焦磷酸的交換反應(yīng)。反應(yīng)式為32P32Pi+dNPPP←dNP32P32P+PPi→DNA

最后兩種作用，都要求有較高濃度的PPi，因此，在體內(nèi)由于沒(méi)有足夠高的PPi而無(wú)重要意義。

DNApolⅠ的DNA聚合酶活性和5'→3'外切酶活性協(xié)同作用，可以使DNA鏈上的切口向前推進(jìn)，即沒(méi)有新的DNA合成，只有核苷酸的交換。這種反應(yīng)叫缺口平移(Nick translation)。當(dāng)雙鏈DNA上某個(gè)磷酸二酯鍵斷裂產(chǎn)生切口時(shí)，DNApoIⅠ能從切口開始合成新的NDA鏈，同時(shí)切除原來(lái)的舊鏈。這樣，從切口開始合成了一條與被取代的舊鏈完全相同的新鏈。如果新?lián)饺氲拿撗鹾塑账崛姿釣棣?32P-dNTP，則重新合成的新鏈即為帶有同位素標(biāo)記的DNA分子，可以用作探針進(jìn)行分子雜交實(shí)驗(yàn)。

盡管DNApolⅠ是第一個(gè)被鑒定的DNA聚合酶，但它不是在腸桿菌中DNA復(fù)制的主要聚合酶。主要證據(jù)如下:[1]純化的DNApolⅠ催化dNTP摻入的速率為667堿基/分，而體內(nèi)DNA合成速率要比此高二倍數(shù)量級(jí);[2]大腸桿菌的一個(gè)突變株中，此酶的活力正常，但染色體DNA復(fù)制不正常;[3]而在另一些突變株中，DNApolⅠ的活力中只是野生型的1%，但是DNA復(fù)制卻正常，而且此突變株增加了對(duì)紫外線、烷化劑等突變因素的敏感性。這表明該酶與DNA復(fù)制關(guān)系不大，而在DNA修復(fù)中起著重要的作用。

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2010-01-02

真核細(xì)胞有bai5種DNA聚合酶，分別為duDNA聚合酶α（定位于胞核，參zhi與復(fù)制引發(fā)具5－3外切酶活性），βdao（定位于核內(nèi)，參與修復(fù)，具5－3外切酶活性），γ（定位于線粒體，參與線粒體復(fù)制具5－3和3－5外切活性），δ（定位核，參與復(fù)制，具有3－5和5－3外切活性），ε（定位于核，參與損傷修復(fù)，具有3－5和5－3外切活性）。

原核細(xì)胞有3種DNA聚合酶，都與DNA鏈的延長(zhǎng)有關(guān)。DNA聚合酶I是單鏈多肽，可催化單鏈或雙鏈DNA 的延長(zhǎng)；DNA聚合酶II則與低分子脫氧核苷酸鏈的延長(zhǎng)有關(guān)；DNA聚合酶III在細(xì)胞中存在的數(shù)目不多，是促進(jìn)DNA鏈延長(zhǎng)的主要酶。

[1]聚合作用:在引物RNA'-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個(gè)將核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的專一性主要表現(xiàn)為新進(jìn)入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對(duì)時(shí)才有催化作用。dNTP進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，促進(jìn)3'-OH與5'-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵。若是錯(cuò)誤的核苷酸進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)，則不能與模板配對(duì)，無(wú)法改變酶的構(gòu)象而被3'-5'外切酶活性位點(diǎn)所識(shí)別并切除之。

[2]3'→5'外切酶活性——校對(duì)作用:這種酶活性的主要功能是從3'→5'方向識(shí)別和切除不配對(duì)的DNA生長(zhǎng)鏈末端的核苷酸。當(dāng)反應(yīng)體系中沒(méi)有反應(yīng)底物dNTP時(shí)，由于沒(méi)有聚合作用而出現(xiàn)暫時(shí)的游離現(xiàn)象，從而被3'→5'外切酶活性所降解。如果提高反應(yīng)體系的溫度可以促進(jìn)這種作用，這表明溫度升高使DNA生長(zhǎng)鏈3'末端與模板發(fā)生分離的機(jī)會(huì)更多，因而降解作用加強(qiáng)。當(dāng)向反應(yīng)體系加入dNTP，而且只加放與模板互補(bǔ)的上述核苷酸才會(huì)使這種外切酶活性受到抑制，并繼續(xù)進(jìn)行DNA的合成。由此推論，3'→5'外切酶活性的主要功能是校對(duì)作用，當(dāng)加入的核苷酸與模板不互補(bǔ)而游離時(shí)則被3'→5'外切酶切除，以便重新在這個(gè)位置上聚合對(duì)應(yīng)的核苷酸。在某些T4噬菌體突變株中DNA復(fù)制的真實(shí)性降低，而易發(fā)生突變，從此突變株分離得到的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性很低。相反，另外一些具有抗突變能力的T4突變株中的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA復(fù)制真實(shí)性好，變異率低?？梢?jiàn)，3'→5'外切酶活性對(duì)DNA復(fù)制真實(shí)性的維持是十分重要的。

[3]5'→3'外切酶活性——切除修復(fù)作用:5'→3'外切酶活性就是從5'→3'方向水解DNA生長(zhǎng)鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5'-脫氧核苷酸。這種酶活性只對(duì)DNA上配對(duì)部份(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是5'→3'。每次能切除10個(gè)核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力達(dá)10倍以上。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起著重要作用。對(duì)岡崎片段5'末端RNA引物的去除依賴此種外切酶活性。

[4]焦磷酸解作用:DNApolⅠ的這種活性可以催化3'末端焦磷酸解DNA分子。這種作用就是無(wú)機(jī)焦磷酸分解DNA生長(zhǎng)鏈，可以認(rèn)為是DNA聚合作用的逆反應(yīng)，而且這種水解DNA鏈作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi←(dNMP)n-x+X(dNPPP)→DNA

[5]焦磷酸交換作用:催化dNTP末端的PPi同無(wú)機(jī)焦磷酸的交換反應(yīng)。反應(yīng)式為32P32Pi+dNPPP←dNP32P32P+PPi→DNA

最后兩種作用，都要求有較高濃度的PPi，因此，在體內(nèi)由于沒(méi)有足夠高的PPi而無(wú)重要意義。

DNApolⅠ的DNA聚合酶活性和5'→3'外切酶活性協(xié)同作用，可以使DNA鏈上的切口向前推進(jìn)，即沒(méi)有新的DNA合成，只有核苷酸的交換。這種反應(yīng)叫缺口平移(Nick translation)。當(dāng)雙鏈DNA上某個(gè)磷酸二酯鍵斷裂產(chǎn)生切口時(shí)，DNApoIⅠ能從切口開始合成新的NDA鏈，同時(shí)切除原來(lái)的舊鏈。這樣，從切口開始合成了一條與被取代的舊鏈完全相同的新鏈。如果新?lián)饺氲拿撗鹾塑账崛姿釣棣?32P-dNTP，則重新合成的新鏈即為帶有同位素標(biāo)記的DNA分子，可以用作探針進(jìn)行分子雜交實(shí)驗(yàn)。

盡管DNApolⅠ是第一個(gè)被鑒定的DNA聚合酶，但它不是在腸桿菌中DNA復(fù)制的主要聚合酶。主要證據(jù)如下:[1]純化的DNApolⅠ催化dNTP摻入的速率為667堿基/分，而體內(nèi)DNA合成速率要比此高二倍數(shù)量級(jí);[2]大腸桿菌的一個(gè)突變株中，此酶的活力正常，但染色體DNA復(fù)制不正常;[3]而在另一些突變株中，DNApolⅠ的活力中只是野生型的1%，但是DNA復(fù)制卻正常，而且此突變株增加了對(duì)紫外線、烷化劑等突變因素的敏感性。這表明該酶與DNA復(fù)制關(guān)系不大，而在DNA修復(fù)中起著重要的作用。

[編輯本段]大腸桿菌DNA聚合酶

1、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(DNApolymeraseⅠ，DNApolⅠ)這是1956年由ArthurKornberg首先發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶，又稱Kornber酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特點(diǎn)。

(1)理化性質(zhì)：純化的DNApolⅠ由一條多肽鏈組成，約含1000個(gè)氨基酸殘基，MW為109KD。分子含有一個(gè)二硫鍵和一個(gè)-SH基。通過(guò)二個(gè)酶分子上的-SH基與Hg2+結(jié)合產(chǎn)生二聚體，仍有活性。每個(gè)酶分子中含有一個(gè)Zn2+，在DNA聚合反應(yīng)起著很重要的作用。每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中含有約400個(gè)分子，每個(gè)分子每分鐘在37℃下能催化667個(gè)核苷酸摻入正在生長(zhǎng)的DNA鏈。經(jīng)過(guò)枯草桿菌蛋白酶處理后，酶分子分裂成兩個(gè)片段，大片段分子量為76KD，通常稱為Klenow片段，小片段的分子量為34KD。此酶的模板專一性和底物專一性均較差，它可以用人工合成的RNA作為模板，也可以用核苷酸為底物。在無(wú)模板和引物時(shí)還可以從頭合成同聚物或異聚物。

DNAPolⅠ在空間結(jié)構(gòu)上近似球體，直徑約65A。在酶的縱軸上有一個(gè)約20A的深溝(cleft)，帶有正電荷，這是該酶的活性中心位置，在此位置上至少有6個(gè)結(jié)合位點(diǎn):[1]模板DNA結(jié)合位點(diǎn);[2]DNA生長(zhǎng)鏈或引物結(jié)合位點(diǎn);[3]引物末端結(jié)合位點(diǎn)，用以專一引物或DNA生長(zhǎng)鏈的3'-OH;[4]脫氧核苷三磷酸結(jié)合位點(diǎn);[5]5'→3'外切酶活性位點(diǎn)，用以結(jié)合生長(zhǎng)鏈前方的5'-端脫氧核苷酸并切除之;[6]3'→5'外切酶活性位點(diǎn)，用以結(jié)合和切除生長(zhǎng)鏈上未配對(duì)的3'-端核苷酸。

2、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)：DNA聚合酶Ⅰ缺陷的突變株仍能生存，這表明DNApolⅠ不是DNA復(fù)制的主要聚合酶。人們開始尋找另外的DNA聚合酶，并于1970年發(fā)現(xiàn)了DNApolⅡ。此酶MW為120KD，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)約有100個(gè)酶分子，但活性只有DNApolⅠ的5%。該酶的催化特性如下：

(1)聚合作用:該酶催化DNA的聚合，但是對(duì)模板有特殊的要求。該酶的最適模板是雙鏈DNA而中間有空隙(gap)的單鏈DNA部份，而且該單鏈空隙部份不長(zhǎng)于100個(gè)核苷酸。對(duì)于較長(zhǎng)的單鏈DNA模板區(qū)該酶的聚合活性很低。但是用單鏈結(jié)合蛋白(SSBP)可以提高其聚合速率，可達(dá)原來(lái)的50-100倍。

(2)該酶也具有3'→5'外切酶活性，但無(wú)5'→3'外切酶活性。

(3)該酶對(duì)作用底物的選擇性較強(qiáng)，一般只能將2-脫氧核苷酸摻入到DNA鏈中。

(4)該酶不是復(fù)制的主要聚合酶，因?yàn)榇嗣溉毕莸拇竽c桿菌突變株的DNA復(fù)制都正常?？赡茉贒NA的損傷修復(fù)中該酶起到一定的作用。

3、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ)：DNA pol Ⅲ全酶由多種亞基組成(見(jiàn)下表)，而且容易分解。大腸桿菌每個(gè)細(xì)胞中只有10-20個(gè)酶分子，因此不易獲得純品，為研究該酶的各種性質(zhì)和功能帶來(lái)了許多困難。直到不久前，才對(duì)其性質(zhì)和功能有所了解，但每個(gè)亞基的具體作用扔不十分清楚。盡管該酶在細(xì)胞內(nèi)存在的數(shù)量較少，但催化脫氧核苷酸摻入DNA鏈的速率分別是DNA聚合酶Ⅱ的15倍和30倍。該酶對(duì)模板的要求與DNA聚合酶Ⅱ相同，最適模板也是鏈DNA中間有空隙的單鏈DNA，單鏈結(jié)合蛋白可以提高該酶催化單鏈DNA模板的DNA聚合作用。DNApolⅢ也有3'→5'和5'→3'外切酶活性，但是3'→5'外切酶活性的最適底物是單鏈?zhǔn)荄NA，只產(chǎn)生5'-單核苷酸，不會(huì)產(chǎn)生二核苷酸，即每次只能從3'端開始切除一個(gè)核苷酸。5'→3'外切酶活性也要求有單鏈DNA為起始作用底物，但一旦開始后，便可作用于雙鏈區(qū)。DNA聚合酶Ⅲ是細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制所必需的酶，缺乏該酶的溫度突變株在限制溫度(non permissive temperature)內(nèi)是不能生長(zhǎng)的，此種突變株的裂解液也不能合DNA，但加入DNA聚合酶Ⅲ則可以恢復(fù)其合成DNA的能力。